劉麗婭 孫夢穎 王延州 鐘 葵 佟立濤 朱 捷 周素梅

（農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193）

熱反應香精是利用氨基酸、多肽等蛋白質(zhì)水解物與還原糖、脂類等在一定條件下加熱發(fā)生美拉德反應（Maillard Reaction，MR）生成的風味物質(zhì)。香料工業(yè)界從20世紀中葉起就開始采用熱反應的方法合成增香調(diào)味品。

目前用于熱反應香精制備的蛋白水解物多為豆粕、花生粕等通過化學或酶法得到的水解產(chǎn)物，對價格低廉、來源豐富的小麥面筋蛋白的研究利用卻相對較少［1－3］。事實上，小麥面筋蛋白的氨基酸組成中含有大量的谷氨酸和脯氨酸，一級結(jié)構(gòu)中富含呈味肽序列［4］。因此，可作為美拉德反應有效的氨基酸來源。其氨基酸組成中半胱氨酸、甲硫氨酸不足的問題，亦可通過添加外加氨基酸來彌補［5］。

基于上述考慮，本研究選擇低值小麥面筋蛋白為原料，利用控制條件下的糖與蛋白質(zhì)水解物發(fā)生Maillard反應，合成咸味香精，并通過固相微萃取－氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術（SPME－GC－MS）分析了肉香產(chǎn)物。該研究對于拓寬小麥面筋蛋白的應用范圍，增加附加值、推動小麥淀粉及肉味香精產(chǎn)業(yè)的發(fā)展－具有重要的現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1．1 材料與試劑

小麥面筋蛋白（蛋白質(zhì)量分數(shù)70．3%）：山東省濱州泰裕麥業(yè)有限公司；Flavourzyme 1000L風味蛋白酶：酶活力1 000 LAPU／g，諾維信（中國）生物技術有限公司。

其他試劑均為分析純。

1．2 主要儀器與設備

UB－7型酸度計、T－214電子分析天平：北京賽多利斯儀器有限公司；2300自動定氮儀：瑞典FOSS公司；Anke LXJ－IIB離心機：上海安亭科學儀器廠；THZ－82A水浴恒溫振蕩器：江蘇榮華儀器制造有限公司。

1．3 方法

1．3．1 小麥面筋蛋白深度酶解產(chǎn)物（E－WHP）的制備

稱取20 g小麥面筋蛋白，邊攪拌邊加入一定量的去離子水中，室溫下攪拌30 min，得到10%的底物懸浮液。用1 mol·L－1的NaOH或HCl溶液調(diào)節(jié)pH至6．0，預熱至55℃后，加入Flavourzyme風味酶，酶與蛋白比例1∶100，在搖床中恒溫振蕩，反應12 h后，將酶解液置于95℃水浴中，保持10 min滅酶。之后用冰水浴迅速冷卻，離心（4 000 r／min，20 min）得上清液，冷凍干燥得到產(chǎn)品（E－WHP）。

1．3．2 蛋白回收率的測定

蛋白回收率采用下式計算，蛋白含量采用凱氏定氮法測定（GB／T 14771—2003）。

式中：原料小麥面筋蛋白的蛋白質(zhì)量分數(shù)為70．3%。

1．3．3 水解度的測定［6－7］

水解度的測定采用甲醛滴定法。具體方法：首先采用甲醛滴定法測定樣品中的—NH2或—COOH基團的含量，然后代入下式求得其水解度。

式中：h為采用甲醛滴定法測定酶解液中的—NH2或—COOH基團的含量／mmol／g；h0為采用甲醛滴定法測定的水解前原料中的—NH2或—COOH基團的含量／mmol／g；htot為每克原料蛋白的肽鍵毫摩爾數(shù)／mmol／g，對于小麥面筋蛋白，htot＝8．38 mmol／g。

1．3．4 美拉德反應制備肉香調(diào)味基料工藝條件的優(yōu)化

取經(jīng)冷凍干燥后的小麥面筋蛋白水解液加去離子水溶解，加入木糖、L－半胱氨酸，攪拌均勻后置于25 mL具塞試管，封口后置于烘箱中加熱。反應結(jié)束后，使反應液迅速冷卻并于4℃冰箱下保存。通過對反應產(chǎn)物的風味進行評價，分別確定最佳反應pH、溫度、pH和各組分的添加量。在單因素試驗基礎上，采用正交試驗確定最佳制備工藝。

1．3．5 美拉德反應產(chǎn)物風味的評定

由9人組成感官評定小組，對美拉德反應產(chǎn)物分別進行氣味和可接受性評分。采用7分制，總分為2個指標分值之和，最高分126分，最低分14分，得出最終感官評分分值。評價標準見表1。

表1 美拉德反應產(chǎn)物的氣味和喜性評分標準

1．3．6 美拉德反應褐變程度的測定

美拉德反應往往伴隨著褐變現(xiàn)象，褐變程度是衡量美拉德反應進程最簡便的方法。將褐變反應液經(jīng)12 000 r／min離心15 min，除去反應產(chǎn)生的不溶物質(zhì)，取所有樣品上清液稀釋10倍，在420 nm波長下，測定吸光值（OD420）。

1．3．7 SPME－GC－MS對揮發(fā)性風味成分的檢測

SPME裝置：自動進樣裝置，萃取頭為聚二甲基硅烷／二乙烯苯碳（PDMS／DVB，涂層厚度 65μm），均購于Supelco公司（美國）。

SPME萃取條件：樣品2 mL，萃取頭加熱攪拌頂空萃取，萃取溫度60℃，平衡時間20 min，萃取時間30 min，振蕩萃取頻率 250 r／min。

GC條件：色譜柱為HP－5MS毛細管柱（30 m×0．25 mm×0．25μm），程序升溫：柱初溫 50℃，保持3 min，以5℃／min升溫至280℃，保持2 min。進樣口溫度為280℃；熱解析2 min；載氣：氦氣，流量1 mL／min，不分流模式進樣。

MS條件：電離源能量為70 eV，離子源溫度280℃，傳輸線溫度250℃，采用scan模式分析。

對樣品進行GC－MS分析后，用氣相色譜－質(zhì)譜－計算機聯(lián)用技術檢測得到美拉德產(chǎn)物中揮發(fā)性氣體總離子圖，各組分質(zhì)譜經(jīng)計算機譜庫（NIST05、NIST05s）檢索及相關文獻分析，確認樣品中各香氣化合物成分，并應用峰面積歸一化法測得各香氣成分相對含量。

2 結(jié)果與討論

2．1 小麥面筋蛋白的深度酶解

毛善勇等［8］采用小麥面筋蛋白酸水解產(chǎn)物制備肉味香精，但在酸水解高溫強酸的條件下，會產(chǎn)生致癌性的1，3－二氯－2－丙醇（1，3－DCP）和3－氯 －1，2丙二醇（3－MCPD），對人體的肝、腎和神經(jīng)系統(tǒng)有極大的損害［9－10］。

酶水解反應條件溫和、可保持氨基酸不被破壞，其水解產(chǎn)物中只有氨基酸和多肽，不產(chǎn)生有毒有害物質(zhì)。通過前期的研究篩選出風味酶對小麥面筋蛋白進行酶解，按照1．3．1中的方法，制備出富含氨基酸和多肽的水解產(chǎn)物，水解度為32．4%，蛋白利用率為87．2%，水解液澄清透明，帶有輕微麥香味。

2．2 美拉德反應制備肉香調(diào)味基料工藝條件的優(yōu)化

2．2．1 單因素試驗

2．2．1．1 反應液初始pH值對香料基液風味和褐變程度的影響

將各試驗材料按配比攪拌均勻（15%E－WHP、5%木糖、1% 半胱氨酸），調(diào)節(jié)pH，密封后于100℃下反應60 min，冷卻后比較pH值對褐變程度和風味的影響。

體系褐變程度和感官評分隨初始pH值的變化如圖1所示。由圖1可知，隨著體系pH值的增加，褐變程度不斷升高。這是因為在酸性溶液中，氨基處于質(zhì)子化狀態(tài)，抑制了葡基胺的形成。值得注意的是，當pH值升高到8時，褐變程度有所降低。劉通訊等［3］在利用花生粕蛋白酶解液合成肉類香味料的研究中也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。另一方面，當初始pH＜4時，反應程度較低，無特征肉香風味；pH＞7時產(chǎn)生的風味較差；而當pH介于4～7之間，反應效果較好。

圖1 pH值對美拉德產(chǎn)物感官評分及褐變程度的影響

2．2．1．2 溫度對香料基液風味和褐變程度的影響

將試驗材料按配比攪拌均勻（15%E－WHP、5%木糖、1%半胱氨酸），調(diào)節(jié)pH為7，密封后于不同外界溫度下加熱反應60 min，冷卻后比較反應溫度對褐變程度和感官評分的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 溫度對美拉德產(chǎn)物感官評分及褐變程度的影響

由圖2可知，溫度對美拉德反應進程影響顯著。在一定范圍內(nèi)，褐變程度和感官評分值均隨溫度的升高不斷增加；但溫度達到145℃時，反應物褐變嚴重，體系出現(xiàn)焦糊味，肉香風味變差。這是因為美拉德反應是典型的熱敏型反應，溫度的升高增加了糖和氨基酸的活性，進而加快化學反應速度。因此，外界溫度控制在115～130℃范圍內(nèi)所生成的肉味純正濃郁。

2．2．1．3 反應時間對香料基液風味和褐變程度的影響

將試驗材料按配比攪拌均勻（15%E－WHP、5%木糖、1% 半胱氨酸），調(diào)節(jié)pH為7，密封后于115℃下加熱不同時間，冷卻后比較反應時間對感觀評分和褐變程度的影響，結(jié)果見圖3。隨著反應時間的延長，氨基酸和還原糖不斷反應，美拉德反應越徹底，褐變程度越深，但是反應時間過長，感官評分值反而降低。

圖3 反應時間對美拉德產(chǎn)物感官評分及褐變程度的影響

2．2．1．4 還原糖添加量對香料基液風味和褐變程度的影響

將試驗材料按配比攪拌均勻（15%E－WHP、1%半胱氨酸），改變其中木糖的添加量，調(diào)節(jié)pH為7，密封后于115℃下加熱60 min，冷卻后比較木糖用量對風味和感官評分的影響。由圖4可知，隨著木糖用量的增加，褐變程度逐漸提高。但是感官評定結(jié)果表明，當木糖添加量增加至10%時，肉香味中帶有較濃的焦糊味。

圖4 木糖添加量對美拉德產(chǎn)物感官評分及褐變程度的影響

2．2．1．5 L－半胱氨酸添加量對香料基液風味和褐變程度的影響

將試驗材料按配比攪拌均勻（15%E－WHP、1%半胱氨酸），改變其中L－半胱氨酸添加量。調(diào)節(jié)pH為7，密封后于115℃下加熱60 min，冷卻后比較半胱氨酸用量對風味和褐變程度的影響。

圖5 半胱氨酸添加量對美拉德產(chǎn)物感官評分及褐變程度的影響

由圖5可知，添加一定量半胱氨酸使體系的褐變程度大大降低，而感官評分值大大提高。這是因為含硫氨基酸通過美拉德反應所產(chǎn)生的含硫化合物、雜環(huán)化合物（包括含硫雜環(huán)化合物）是形成肉味香氣的主要成分。小麥面筋蛋白本身含硫氨基酸很少，在外加半胱氨酸情況下，半胱氨酸經(jīng)Strecker降解首先產(chǎn)生巰基乙醛，再繼續(xù)分解產(chǎn)生乙醛和硫化氫，這些化合物在肉香風味的形成中起到關鍵作用［3］。繼續(xù)提高半胱氨酸的用量，褐變程度和風味變化不大。

2．2．2 美拉德反應條件的正交優(yōu)化

根據(jù)影響風味物質(zhì)形成的主要因素，選擇pH、溫度（℃）、反應時間（min）、木糖和半胱氨酸添加量（g）作為影響因素，按 L16（45）表進行正交試驗。以感官評分值為指標，采用SAS 8．0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。試驗結(jié)果和數(shù)據(jù)處理見表2、表3。

表2 5因素4水平正交試驗結(jié)果

續(xù)表

表3 方差分析

從表2、表3可知，5個因素對美拉德產(chǎn)物的感官評分具有極顯著的影響（P＜0．000 1），影響程度由大到小依次為A（pH）＞E（半胱氨酸添加量）＞B（溫度）＞C（時間）＞D（木糖添加量）。極差分析結(jié)果表明美拉德反應的最佳工藝組合為：A3B3C4D4E4，即添加6%木糖和1．25% 半胱氨酸，pH 7、115℃，反應75 min。

2．2．3 美拉德反應產(chǎn)物GC－MS分析結(jié)果

采用相微萃?。瓪庀啵|(zhì)譜技術對利用最佳工藝（15%E－WHP、6% 木糖、1．25% 半胱氨酸，pH7、115℃，反應75 min）制備得到的美拉德產(chǎn)物進行分析，其揮發(fā)性成分種類和相對含量如表4所示。從產(chǎn)物中共鑒定出46種風味化合物，主要成分有醛、酮、酚、有機酸類物質(zhì)，以及個別呋喃、硫醇類、噻唑、噻吩。噻吩和硫醇類物質(zhì)是已被證明的具有明顯肉味特征的含硫化合物，特別是3位被硫醇取代的呋喃和噻吩［11－12］。在本試驗中，2－甲基 －3－呋喃硫醇的相對含量較高，該化合物具有很高的風味釋放因子，閾值非常低，僅為 0．005～0．010μg／kg［14］。同時，揮發(fā)性組分中的糠醛、糠硫醇也是重要的肉香味化合物，對產(chǎn)品風味的形成具有重要的作用；苯甲醛、壬醛分別具有苦杏仁味和油炸香，辛酸、壬酸、癸酸具有淡的水果香氣，這些化合物可能對氣味加成或協(xié)同作用的效果，也被認為是非常有效的風味修飾劑。此外，揮發(fā)性物質(zhì)中4，5－二甲基－1，3－二氧雜環(huán)戊烯－2－酮含量較高的，該化合物在醫(yī)藥工業(yè)中被用作制備抗高血壓藥的中間體，在肉香風味的揮發(fā)物中并不多見，其形成機制有待于進一步研究。

表4 小麥面筋蛋白美拉德產(chǎn)物中揮發(fā)性風味成分的GC－MS鑒定結(jié)果

3 結(jié)論

3．1 采用風味酶酶解小麥面筋蛋白，蛋白利用率高，反應條件溫和，無有害物質(zhì)產(chǎn)生，得到了水解度較高的面筋蛋白水解液。

3．2 將小麥面筋蛋白酶解液與半胱氨酸和木糖共混后加熱，制備出了具有肉香風味的美拉德產(chǎn)物。并利用正交試驗優(yōu)化了反應工藝，獲得的最佳條件為：15%E－WHP、6% 木糖、1．25% 半胱氨酸，pH7、115℃，反應75 min。

3．3 通過SPME－GC－MS鑒定了美拉德產(chǎn)物中的揮發(fā)性物質(zhì)的組分和相對含量，為利用小麥面筋蛋白水解物制備肉香調(diào)味基料提供了理論依據(jù)。

［1］Aaslyng M D，Martens M，Poll L，et al．Chemical and sensory characterization of hydrolyzed vegetable protein，a savory flavoring［J］．Journal of Agricultural and Food Chemistry，1998，46：481－489

［2］Wu Y F，Baek H H，Gerard PD，et al．Development of a meat－like process flavoring from soybean－based enzyme－h(huán)ydrolyzed vegetable protein（E－HVP）［J］．Journal of Food Science，2000，65（7）：1220－1227

［3］劉通訊，吳肖．花生粕蛋白酶解液Maillard反應合成肉類香味料的研究［J］．食品科學，2001，22（4）：25－27

［4］王金水．酶解－膜超濾改性小麥面筋蛋白功能特性研究［D］．華南理工大學，2007

［5］Sun L，Zhuang Y．Characterization of the maillard reaction of enzyme hydrolyzed wheat protein producing meaty aromas［J］．Food and Bioprocess Technology，2012，5：1287－1294

［6］趙新淮，馮志彪．蛋白質(zhì)水解物水解度的測定［J］．食品科學，1994，11：65－67

［7］Adler－Nissen J．Enzymic Hydrolysis of Food Proteins［M］．London：Elsevier Applied Science Publishers，1986：12－14

［8］毛善勇，周瑞寶．水解植物蛋白制備肉味香精的研究［J］．中國油脂，2004，9（1）：62－64

［9］Velisek J，Davidek J，Kubelka，V，et al．New chlorine－containing organic compounds in protein hydrolysates［J］．Journal of Agricultural and Food Chemistry，1980，28（6）：1142－1144

［10］Velisek J，Ledahudcova K，Hajslova J，et al．New 3－chloro－1，2－propanediol derived dihydroxypropylamines in hydrolyzed vegetable proteins［J］．Journal of Agricultural and Food Chemistry，1992，40（8）：1389－1392

［11］孫寶國．肉味香精技術進展［J］．食品科學，2004，25（10）：339－342

［12］孫麗平，汪東風，張莉，等．利用鱈魚皮蛋白制備熱反應型肉香調(diào)味基料的研究［J］．中國海洋大學學報，39（2）：249－252

［13］Gasser U，Grosch W．Identification of volatile flavour compounds with high aroma values from cooked beef［J］．Z．Lebensm．Unters．Forsch，1988，186，111－113．