張洪梅 周泉城

（山東理工大學農(nóng)業(yè)工程與食品科學學院，淄博 255049）

文冠果是我國特有的珍貴優(yōu)良木本油料樹種，在生物柴油開發(fā)、新木材培植、水土保持以及觀賞植物領(lǐng)域等各方面，都有著極大的開發(fā)利用價值［1］。近年來，由于文冠果具有較高的工業(yè)價值和營養(yǎng)價值，越來越受到人們的關(guān)注。如今我國大量種植文冠果，種仁多用于榨油，而果殼作為廢棄物未得到有效的利用。研究表明，文冠果果殼中含有脂肪酸、甾醇、黃酮、皂苷等多種化學成分，其中皂苷類成分是其主要活性成分。

皂苷（Saponin）是廣泛存在于植物界的一類特殊的苷類，。近年研究表明：文冠果總皂苷具有抗炎、抗腫瘤、抑制HIV蛋白酶、改善學習記憶以及提高人體抗糖尿等活性［2］。

酪氨酸酶（Tyrosinase）是一種結(jié)構(gòu)復雜的多亞基的含銅氧化還原酶［3］，廣泛的存在于微生物、動植物及人體中［4－7］。酪氨酸酶是目前黑色素代謝中唯一已知的酶，也是生物合成黑色素細胞的主要限速酶，在黑色素產(chǎn)生的過程中起著舉足輕重的作用。酪氨酸酶活性高，產(chǎn)生的黑色素就會多；活性被抑制，黑色素產(chǎn)生能力就相應降低。異常過量表達可導致人體色素沉積性疾病。酪氨酸酶抑制劑可以治療目前常見的色素沉積導致的皮膚病如雀斑、黃褐斑、老年斑等［8］。

目前，市場上流行的美白化妝品中增白劑多是酪氨酸酶抑制劑，如熊果苷、維生素C衍生物及一些中藥提取物等［9］。此外，酪氨酸酶還與昆蟲的傷口愈合與發(fā)育［6］，果蔬的褐變有密切關(guān)系［10－12］。因此，酪氨酸酶抑制劑也被用作食品保鮮劑。

本試驗旨在確定文冠果殼中皂苷的提取方法，并對文冠果皂苷對酪氨酸酶的抑制作用進行研究，以期為文冠果殼的合理開發(fā)利用提供思路和依據(jù)，更高的發(fā)揮文冠果的經(jīng)濟價值。

1 材料與方法

1．1 試驗材料

文冠果：陜西金道種業(yè)有限公司；酪氨酸酶（≥30 U／mg）：合肥博美生物科技有限公司，臨用前以pH＝6．8磷酸緩沖液配成適宜濃度酶溶液；所用其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1．2 試驗設備

FZ102植物粉碎機：天津泰斯特儀器公司；RE 52－86E旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；SHB－111循環(huán)水式真空泵：鄭州金育科貿(mào)有限公司；TDL－40B離心機：上海安亭科學儀器廠；UV－2102紫外－可見分析儀：尤尼柯儀器有限公司。

1．3 試驗方法

1．3．1 文冠果皂苷提取

1．3．1．1 乙醇提取流程

文冠果殼粉末→石油醚脫脂→乙醇提取→過濾→濃縮

稱取干燥恒重的文冠果果殼粉末20 g，置200 mL圓底燒瓶中，60～90℃石油醚脫脂3次，液料比5∶1，時間4 h。加入70%的乙醇140 mL，于70℃冷凝回流5 h。濾去殘渣，回收乙醇至20%，繼續(xù)回收乙醇得浸膏。將浸膏8倍水量溶解，3 500 r／min離心分離15 min，取上清液用乙酸乙酯（1∶1）萃取3次，除去部分雜質(zhì)，水層繼續(xù)用水飽和的正丁醇（1∶1）萃取3次，合并正丁醇相，濃縮得浸膏。

1．3．1．2 水提取流程

文冠果殼粉末→石油醚脫脂→水提→過濾→濃縮

稱取干燥恒重的文冠果果殼粉末20 g，置200 mL圓底燒瓶中，60～90℃石油醚提取3次脫脂，液料比5∶1，時間4 h。加入去離子水（pH值為10．5～11．5）140 mL，于 90℃冷凝回流 120 min。濾去殘渣，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，3 500 r／min離心分離15 min，取上清液用乙酸乙酯（1∶1）萃取3次，除去部分雜質(zhì)，水層繼續(xù)用水飽和的正丁醇（1∶1）萃取3次，合并正丁醇相，濃縮得浸膏。

1．3．2 樣品中皂苷質(zhì)量分數(shù)的測定

1．3．2．1 標準曲線

標準曲線按香草醛比色法操作［13］。人參皂苷Re標準曲線方程：Y＝2．963 2X－0．010 3，R2＝0．999 3。式中：Y為吸光度；X為皂苷的質(zhì)量分數(shù)。

1．3．2．2 皂苷質(zhì)量分數(shù)計算

將正丁醇相濃縮得到的浸膏用60 mL水溶解，經(jīng)濾膜過濾，吸取0．5 mL加入100 mL的容量瓶中用甲醇定容至刻度制備成待測液。吸取0．5 mL于試管中，按香草醛比色法操作，3個平行，取平均值。根據(jù)標準曲線方程求出提取物中皂苷的質(zhì)量分數(shù)。

回歸方程：Y＝2．963 2X－0．010 3（R2＝0．999 3）

質(zhì)量分數(shù) ＝100NV（吸光度 ＋0．010 3）／（2．963 2×2．5×1 000M）×100%

式中：N為稀釋倍數(shù)；V為溶液體積／mL；M為原料質(zhì)量／g。

1．3．3 抑制酪氨酸酶活性試驗

1．3．3．1 酪氨酸酶抑制活性測定方法及抑制率計算

［14］操作：酪氨酸酶活力以催化L－多巴氧化反應生成多巴醌的二酚酶活力來衡量。試管中加入L－多巴0．4 mL（1．0 mg／mL），pH＝6．8磷酸緩沖液2．4 mL，30℃水浴保溫10 min后，加入酪氨酸酶0．2 mL（250 U／mL）混和均勻，酶促反應將L－多巴轉(zhuǎn)化為紅色產(chǎn)物多巴醌，在475 nm處有最大吸收。以每分鐘A475增加0．001為1個酶活力單位，酶促反應的速度用每分鐘A475增加值來表示。從混合均勻開始測量，每30秒測定1次，測到7 min。按如下兩式計算相對酶活力和酶抑制率。

式中：A1為無澄清液有底物時的吸光度；A2為無澄清液無底物時的吸光度；A3為有澄清液與底物時的吸光度；A4為有澄清液無底物時的吸光度。

1．3．3．2 不同濃度皂苷提取液對酪氨酸酶活力的影響

按1．3．3．1方法，在試管中加入底物 0．4 mL，加入不同量的抑制劑，pH＝6．8磷酸緩沖液補充反應液至2．8 mL，30℃水浴保溫10 min后，加入酪氨酸酶0．2 mL（250 U／mL）混和均勻測定各反應的吸光度變化，計算抑制率。

1．3．3．3 不同加酶量對抑制作用的影響

在30℃下取定量的底物溶液與定量的抑制劑，30℃水浴保溫10 min，加入不同量的酪氨酸酶，測定各反應的吸光度變化，計算抑制率。

1．3．3．4 不同反應時間下對抑制作用的影響

取定量的底物溶液與定量抑制劑于30℃水浴保溫10 min，然后加入定量的酪氨酸酶反應不同的時間，測定有無抑制劑加入情況下反應液的吸光度變化，計算抑制率。

1．3．3．5 文冠果皂苷對酪氨酸酶促反應動力學及抑制作用類型

其他條件相同，在反應體系加入定量酪氨酸酶，給定抑制劑濃度，測定底物濃度不同時酶反應的吸光值，求出相應的反應速度。按Lineweaver－Burk的雙倒數(shù)作圖法作圖，確定抑制作用的類型，得出米氏常數(shù)Km、最大反應速度Vmax。

2 結(jié)果與分析

2．1 皂苷的提取與質(zhì)量分數(shù)測定

分別采用醇提取法與水提取法對文冠果果殼進行浸提，分別測定不同浸提次數(shù)提取液的吸光度，帶入回歸方程計算皂苷的質(zhì)量分數(shù)。

表1 文冠果殼皂苷質(zhì)量分數(shù)

由表1可知，醇提取法和水提取法提取文冠果殼中皂苷質(zhì)量分數(shù)分別為2．5%左右和1．5%左右。乙醇提取法測得文冠果殼中皂苷的質(zhì)量分數(shù)較高，表明乙醇溶液作為提取劑更佳。選用醇提取液作為抑制劑，測定文冠果殼皂苷提取液對酪氨酸酶活性的抑制作用。

2．2 抑制酪氨酸酶活性試驗

2．2．1 酪氨酸酶催化L－多巴氧化反應吸光度隨時間的變化

酪氨酸酶催化L－多巴轉(zhuǎn)化為紅色產(chǎn)物多巴醌，反應液中顏色的深淺與產(chǎn)物的濃度成正比?？疾旆磻何舛入S反應時間的變化，試驗結(jié)果見圖1。由圖1可知，隨著時間的延長，反應體系的吸光度增大，即多巴醌的濃度增加，但曲線的斜率的逐漸減小，意味著反應速度降低。7 min時，曲線斜率接近零，反應不再進行，因此試驗選擇測定時間為0～7 min。

圖1 酪氨酸酶催化L－多巴氧化反應進程曲線

2．2．2 不同質(zhì)量濃度皂苷提取液對酪氨酸酶活力的影響

反應體系中底物質(zhì)量濃度為0．133 mg／mL，加入不同量的抑制劑，補充pH＝6．8磷酸緩沖液保持反應液體積為3 mL，測定各反應在不同時間下的吸光度變化，進而得出不同濃度的抑制劑對酪氨酸酶活性的抑制率變化見圖2。

圖2 文冠果殼提取液對酪氨酸酶活性的抑制作用

由圖2可知，文冠果皂苷對酪氨酸酶有抑制作用，反應時間相同時，抑制劑濃度增大，抑制率增加。但以0．24 mg／mL為界，質(zhì)量濃度繼續(xù)增加，抑制率趨于平穩(wěn)，最高可達64．6%，表明文冠果皂苷對酪氨酸酶的抑制率與濃度呈非線性變化。同質(zhì)量濃度的抑制劑對酪氨酸酶活性的抑制作用隨著時間的延長而降低。質(zhì)量濃度為0．24 mg／mL的抑制劑作用于酪氨酸酶，反應時間為1 min時抑制率為63．8%，反應時間為7 min時，抑制率為55．2%。

2．2．3 不同加酶量對抑制作用的影響

在30℃下取定量的底物溶液與定量的抑制劑，30℃水浴保溫10 min，加入不同量的酪氨酸酶，測定各反應在不同時間下的吸光度變化，進而計算不同加酶量對酪氨酸酶活性抑制作用的影響，見圖3。

圖3 加酶量對酪氨酸酶活性抑制作用的影響

由圖3可以得知：當?shù)孜锱c抑制劑濃度一定時，在酪氨酸酶濃度為4．167～25 U／mL之間，酶量對抑制率無明顯影響，表明文冠果皂苷提取液對酪氨酸酶的抑制作用較穩(wěn)定。

2．2．4 不同反應時間時皂苷提取液對酪氨酸酶抑制作用的影響

取定量的底物溶液與定量抑制劑于30℃水浴保溫10 min，然后加入定量的酪氨酸酶反應不同的時間，分別測定抑制劑質(zhì)量濃度為 0．24、0．36、0．48、0．60 mg／mL下反應液的吸光度變化，得出不同反應時間時，抑制劑對酪氨酸酶抑制率的變化見圖4。

圖4 反應時間對酪氨酸酶活性抑制作用的影響

由圖4可以得知：不同質(zhì)量濃度的皂苷提取液對酪氨酸酶活性抑制率的變化趨勢一致，反應初始時抑制率最高，隨時間的延長逐漸降低。

2．2．5 文冠果皂苷對酪氨酸酶促反應動力學的影響及抑制作用類型

固定抑制劑質(zhì)量濃度（0、0．024 mg／mL）及定量的酪氨酸酶，測定不同底物濃度時酶促反應的殘余酶活，求出相應的反應速率，用底物濃度對反應速率做圖，結(jié)果如圖5所示。

圖5 底物濃度對反應速率的影響

用底物濃度的倒數(shù)和反應速率的倒數(shù)做圖，得到相應相應的Lineweaver－Burk圖，見圖6。

圖6 抑制作用Lineweaver－Burk圖

從圖6的動力學曲線可知：兩條直線相交于橫軸副軸上，交點坐標為（－0．8，0）。未加文冠果皂苷提取液的試驗組動力學參數(shù) Km＝1．25 mg／mL，Vmax＝0．12ΔA／min。加入提取液的試驗組動力學參數(shù)Km＝1．25 mg／mL，Vmax＝0．09ΔA／min。結(jié)果顯示加入抑制劑的試驗組Km值不變，Vmax減小，表明文冠果殼皂苷提取液對酪氨酸酶的抑制作用類型為非競爭性抑制。文冠果皂苷作為抑制劑與酪氨酸酶活性中心以外的必需基團結(jié)合，不影響酶與L－多巴的結(jié)合，酶和L－多巴的結(jié)合也不影響酶與文冠果皂苷的結(jié)合，但是中間產(chǎn)物酶－L－多巴－文冠果皂苷復合物不能進一步釋放出產(chǎn)物，從而抑制了L－多巴向多巴醌及向黑色素的轉(zhuǎn)化。

3 結(jié)論

3．1 利用醇提取法和水提取法分別提取文冠果果殼中的皂苷物質(zhì)，結(jié)果醇提取法測得質(zhì)量分數(shù)為2．5%左右，水提取法質(zhì)量分數(shù)1．5%。經(jīng)過比較可以得知醇提取法能更加充分的提取出文冠果殼中的皂苷。在資源利用率和價值利用率上來講，醇提法比水提法要好。

3．2 本試驗發(fā)現(xiàn)，文冠果殼皂苷醇提取液對酪氨酸酶的活性存在一定抑制作用，且隨濃度的增加對酶活性的抑制作用顯著增強，當皂苷質(zhì)量濃度為0．36 mg／mL時，抑制率可達到64．6%。因此，從文冠果殼中提取皂苷作為美白成分，既符合當前以天然藥物為美容成分的發(fā)展趨勢，同時又實現(xiàn)了廢物利用，提高了農(nóng)產(chǎn)品的經(jīng)濟價值。

3．3 文冠果殼皂苷提取液對酪氨酸酶的抑制作用符合非競爭抑制的特點，米氏常數(shù)為1．25 mg／mL。

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