蔡凱凱 黃占旺 沈柱英 孫長濤

（江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點實驗室江蘇省高等學(xué)校天然產(chǎn)物研究與開發(fā)重點實驗室江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，南昌 330045）

納豆芽孢桿菌（Bacillus natto）是從日本的傳統(tǒng)發(fā)酵食品納豆中發(fā)現(xiàn)并分離出來的一種益生菌，其代謝產(chǎn)物納豆激酶具有十分有效地溶栓效果［1－2］，而其菌體本身、芽孢和其他代謝產(chǎn)物對于宿主也具有很好的腸道菌群調(diào)節(jié)作用及提高免疫的功效［3－7］。目前，在納豆芽孢桿菌的高密度液態(tài)發(fā)酵中，普遍直接使用蔗糖和葡萄糖等作為碳源，導(dǎo)致生產(chǎn)成本相對較高。

米糠是稻谷在碾米過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)品，是糙米碾壓過程中被碾下的皮層及少量米胚和碎米的混合物。約占稻谷質(zhì)量的5%～8%［8］。米糠是一種可再生的、廉價的、數(shù)量巨大的低值生物質(zhì)原料，其富含淀粉、纖維素、蛋白質(zhì)、脂肪、糖類、維生素和礦物質(zhì)等各種營養(yǎng)物質(zhì)［9］，米糠中以淀粉含量最高，約為33%，如能將其全部轉(zhuǎn)化為葡萄糖，則可作為納豆菌液態(tài)發(fā)酵碳源的優(yōu)質(zhì)原料。另外還有研究顯示，經(jīng)納豆菌發(fā)酵后的米糠提取物及上清液具有很好的抗氧化、抗衰老和調(diào)節(jié)腸道功能的作用［10－13］。因此，利用米糠作為發(fā)酵基質(zhì)來發(fā)酵納豆菌，不僅可以節(jié)省生產(chǎn)成本，還為以后研制納豆芽孢桿菌－米糠微生態(tài)制劑提供一定的技術(shù)指標(biāo)和試驗基礎(chǔ)。

本研究主要就利用米糠淀粉作為納豆芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵的碳源，對米糠淀粉的水解工藝展開試驗，通過查閱有關(guān)文獻［14－19］，選取細菌α－淀粉酶對米糠中的淀粉進行初步水解，再用糖化酶對水解產(chǎn)物進行糖化，并對其工藝進行研究，以獲得最佳工藝條件。

1 材料與方法

1．1 材料與設(shè)備

1．1．1 試驗材料

米糠粉末：江西吉安縣；α－淀粉酶：北京索萊寶科技有限公司；糖化酶：廣西南寧龐博生物工程有限公司，均為食品添加劑級；其他試劑均為分析純。

1．1．2 試驗儀器

電子萬用爐：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；PHB－5型pH計：杭州雷磁分析儀器廠；AR2140電子分析天平：奧豪斯國際貿(mào)易有限責(zé)司；SW－600－2S數(shù)顯三用恒溫水箱：金壇市科析儀器有限公司；10L－4B型電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海市實驗儀器總廠；V－5600型可見分光光度計：上海元析儀器有限公司。

1．2 試驗方法

1．2．1 米糠基本成分的測定［20］

粗淀粉含量測定采用酸水解法；粗蛋白含量測定采用常量凱氏定氮法（GB 5511—1985）；粗脂肪含量測定采用索氏抽提法（GB 5512—1985）；水分含量測定采用常壓干燥恒重法（GB 5497—1985）；總灰分測定采用灼燒重量法（GB 5505—1985）。

1．2．2 測定指標(biāo)

米糠水解液中還原糖的測定采用斐林試劑法［21］，淀粉水解程度用DE值來表示。

DE值＝料液中還原糖含量／料液中淀粉含量×100%。

淀粉轉(zhuǎn)化率＝DE值／1．11。

1．2．3 工藝路線

米糠50 g→加水調(diào)整料液比為1∶5→100℃水浴糊化1 h→加α－淀粉酶液化30 min→煮沸5 min滅酶→加水調(diào)整料液比為1∶5→調(diào)整pH→加糖化酶糖化→煮沸5 min滅酶→調(diào)整至初始質(zhì)量→DE值的測定

1．2．4 液化單因素試驗［17，19，22］

加酶量對液化效果的影響：稱取米糠粉末10 g，加50 mL水?dāng)嚢杈鶆?，自然pH（6．0），置于水浴鍋中100℃糊化60 min，取出冷卻至50℃后，以米糠為底物，選取0、4、8、12、16、20 u／g 6個加酶量水平，加入CaCl20．3%，70℃水浴鍋中液化30 min，接著煮沸滅酶5 min，冷卻補水至初重，測定還原糖含量。

溫度對液化效果的影響：稱取米糠粉末10 g，加50 mL水?dāng)嚢杈鶆?，自?pH（6．0），置于水浴鍋中100℃糊化60 min，取出冷卻至50℃后，加酶12 u／g，加入 CaCl20．3%，選取 50、60、70、80、90℃5個水平的溫度進行液化30 min，取出后煮沸5 min，冷卻補水至初重，測定還原糖含量。

CaCl2添加量對液化效果的影響：稱取米糠粉末10 g，加50 mL水?dāng)嚢杈鶆?，自?pH（6．0），置于水浴鍋中100℃糊化60 min，冷卻至50℃后選取0%、0．1%、0．2%、0．3%、0．4%、0．5%6個梯度的 CaCl2添加量，加酶 12 u／g，70℃反應(yīng) 30 min，滅酶，測定還原糖含量。

1．2．5 液化正交試驗

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，進一步設(shè)計L9（34）正交試驗，以確定最佳液化條件。液化正交試驗因素水平見表1。

表1 液化正交設(shè)計表

1．2．6 糖化單因素試驗［18－19，23］

加酶量對糖化效果的影響：將在最優(yōu)液化條件下米糠液化液用糖化酶進行糖化試驗，稱取液化米糠30 g，攪拌均勻，調(diào)節(jié)至 pH 4．5，溫度60℃，加酶量梯度為 50、100、150、200、250、300 u／g，酶解 120 min，測定還原糖含量。

溫度對糖化效果的影響：稱取液化米糠30 g，攪拌均勻，調(diào)節(jié)至 pH 4．5，以 40、50、60、70、80℃為溫度梯度，在加酶量為200 u／g的條件下酶解120 min，測定還原糖含量。

pH值對糖化效果的影響：稱取液化米糠30 g，攪拌均勻，選取 pH 3．5、4．0、4．5、5．0、5．5作為梯度，60℃下加酶200 u／g，酶解120 min，測定還原糖含量。

糖化時間對糖化效果的影響：稱取液化米糠30 g，攪拌均勻，在 pH 4．5，溫度 60℃，加酶量 200 u／g條件下分別酶解 0．5、1、2、4、6、8 h，測定還原糖含量。

1．2．7 糖化正交試驗

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，進一步設(shè)計L16（45）正交試驗，以確定最佳糖化條件。糖化正交試驗因素水平見表2。

表2 糖化正交設(shè)計表

1．2．8 數(shù)據(jù)處理

單因素采用Excel處理，正交試驗采用DPS數(shù)據(jù)處理軟件進行分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 米糠基本成分

米糠基本成分分析見表3。

表3 米糠基本成分

不同品種的稻谷和不同的碾米工藝制成的米糠，其含有的成分也會有很大差異，趙鑫等［9］就不同品種米糠的營養(yǎng)成分含量做過相關(guān)性分析，結(jié)果表明不同品種的米糠，水分、蛋白質(zhì)和灰分含量的差異相對較小，而脂肪含量的差異則十分顯著，從10%到24%不等。

2．2 單因素及正交試驗

2．2．1 液化單因素試驗

2．2．1．1 加酶量對液化 DE值的影響

液化加酶量單因素的結(jié)果見圖1，可以看出，加酶量對液化有較大影響，在加酶量較少的時候，酶濃度較低，因此反應(yīng)比較慢，隨著加酶量的增加，酶促反應(yīng)會逐漸加快，DE值升高；當(dāng)加酶量大于16 u／g時，雖然加酶量充足，但底物濃度卻相對降低了，因此DE值的增大不顯著。綜合考慮，選取8、12、16 u／g 3個加酶量水平作為正交試驗的水平。最適加酶量為 16 u／g。

圖1 加酶量對液化DE值的影響

2．2．1．2 溫度對液化 DE值的影響

液化溫度單因素的結(jié)果見圖2，酶解反應(yīng)溫度在50～60℃時，DE值呈增大趨勢；當(dāng)溫度大于60℃時，DE值呈減少趨勢。一方面是因為α－淀粉酶作用于淀粉時是從淀粉分子的內(nèi)部任意切開α－1，4糖苷鍵，使淀粉分子降解。隨著溫度的升高，淀粉分子的運動加強，酶與淀粉分子內(nèi)部的α－1，4糖苷鍵接觸幾率增加，受降解的α－1，4糖苷鍵增加，使DE值增大。另一方面，一開始反應(yīng)溫度升高，逐漸接近酶的最適溫度，因此DE值也升高。但超過60℃之后，雖然淀粉分子運動進一步加快，但由于過了淀粉酶的最適溫度，所以DE值反而逐漸降低。因此，選取50、60、70℃3個溫度水平作為正交試驗的水平。最適溫度為60℃。

圖2 溫度對液化DE值的影響

2．2．1．3 CaCl2添加量對液化 DE值的影響

CaCl2添加量單因素的結(jié)果見圖3，作為α－淀粉酶的保護劑和激活劑，鈣離子濃度增加，液化DE值也隨之增加，但增加的幅度不大?？紤]到生產(chǎn)成本等因素，CaCl2最適添加量為0．2%～0．4%，因此選取0．2%、0．3%、0．4%3個水平作為正交試驗的水平。

圖3 CaCl2添加量對液化DE值的影響

2．2．2 液化正交試驗

為了確定在多因素條件下米糠淀粉液化的最佳條件并了解各因素對液化影響的差異大小，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以DE值為評定指標(biāo)，對加酶量、溫度、CaCl2添加量3個因素做L9（34）正交試驗。液化正交試驗的結(jié)果分析見表4～表6。

表4 液化正交試驗結(jié)果直觀分析

表5 液化正交試驗結(jié)果方差分析

從表4液化正交試驗結(jié)果直觀分析表可知，影響液化DE值各因素主次關(guān)系為：加酶量＞溫度＞CaCl2添加量，得出米糠淀粉液化的最佳工藝參數(shù)為A3B2C1，即加酶量為16 u／g，溫度為60℃，CaCl2添加量0．2%。在理論最佳工藝基礎(chǔ)上進行了驗證性試驗，得到DE值為24．31%。

從表5方差分析表可知，加酶量和溫度對米糠淀粉液化度的影響極顯著，CaCl2添加量對米糠淀粉液化度的影響不顯著。在酶水解過程中，酶的添加量和底物濃度是決定酶促反應(yīng)速度的物質(zhì)基礎(chǔ)，所以加酶量對于試驗結(jié)果的影響最顯著。適宜的反應(yīng)條件是酶高效反應(yīng)的重要前提，溫度過高過低，都會抑制酶的活性，因此溫度對試驗結(jié)果的影響也很顯著。Ca離子在反應(yīng)過程中雖然起到了保護劑和促進劑的作用，但對于整體的酶促反應(yīng)影響并不是特別重要，因此結(jié)果顯示并不顯著。至于pH，因為糊化后的米糠約pH 6．0，接近淀粉酶的最適pH，而且糊化米糠很粘稠，難以調(diào)整pH，因此未進行優(yōu)化。

在方差分析的基礎(chǔ)上進一步對A因素和B因素進行多重比較，由表6可知，在0．05水平下，A因素的3個水平和B因素的3個水平之間差異都是顯著的，在0．01水平下，A因素的3個水平之間差異依然是顯著的，而B因素的水平2和水平1之間差異不顯著，水平1和水平3之間差異顯著。

表6 液化正交結(jié)果多重比較表（Duncans新復(fù)極差法）

2．2．3 糖化單因素試驗

2．2．3．1 加酶量對糖化 DE值的影響

圖4 加酶量對糖化DE值的影響

糖化加酶量單因素結(jié)果見圖4，DE值隨著加酶量的增加而增大，當(dāng)加酶量超過200 u／g時，隨著酶用量的增加，底物濃度降低，反應(yīng)效率降低，DE值增大不多。考慮到生產(chǎn)成本因素，糖化酶的最適添加量為200 u／g，并選取50、100、150、200 u／g 4個水平作為正交試驗的水平。

2．2．3．2 溫度對糖化 DE值的影響

糖化溫度單因素試驗結(jié)果見圖5，60℃之前，糖化DE值隨著溫度的升高而增加，因為溫度逐漸接近酶的最適溫度，在60℃左右達到最大值。超過60℃之后，溫度過高，超過了酶的最適溫度，酶的活性反而被抑制了，DE值也隨之降低。并且隨著溫度上升，葡萄糖分子中的羰基和水解液中的一些氨基發(fā)生美拉德反應(yīng)［23］，都會在一定程度上影響DE值。所以，糖化酶的最適溫度為60℃。綜合考慮，選取50、60、70、80℃4個溫度水平作為正交試驗的水平。

圖5 溫度對糖化DE值的影響

2．2．3．3 pH對糖化 DE值的影響

糖化pH單因素結(jié)果見圖6，當(dāng)酶解反應(yīng)為的pH 3～4．5時，DE值逐漸升高；當(dāng)酶解反應(yīng)為pH 4．5～6時，DE值逐漸降低。由于pH的變化會引起酶的活性中心或酶分子出現(xiàn)構(gòu)象上的變化，影響其與底物的結(jié)合能力和催化能力［24］，所以影響酶的活性。因此，選取 pH 4．5作為最適 pH，并選取 4．0、4．5、5．0、5．5 4個水平作為正交試驗的水平。

圖6 pH對糖化DE值的影響

2．2．3．4 時間對糖化 DE值的影響

糖化時間單因素結(jié)果見圖7，反應(yīng)時間在6 h之前，隨著反應(yīng)時間的延長，DE值迅速增大；6 h后，DE值有所增加但變化不大。由于酶反應(yīng)具有高效性和高度專一性，在適當(dāng)?shù)臏囟认潞蚿H時，反應(yīng)速率迅速提高，但反應(yīng)到一定時間后，底物濃度會相對降低，所以酶解反應(yīng)也會減速，使得DE值增加不顯著。因此，考慮到生產(chǎn)效率等因素，選取6 h作為最佳糖化時間，并選取2、4、5、6 h 4個水平作為正交試驗的水平。

圖7 時間對DE值的影響

2．2．4 糖化正交試驗

為了確定在多因素條件下米糠淀粉糖化的最佳條件并了解各因素對糖化影響的差異大小，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以DE值為評定指標(biāo)，對加酶量、溫度、pH、時間4個因素做L16（45）正交試驗。糖化正交試驗的結(jié)果分析見表7～表9。

表7 糖化正交試驗結(jié)果直觀分析

表8 糖化正交試驗結(jié)果方差分析

由表7糖化正交試驗結(jié)果直觀分析表可知，影響糖化度各因素的主次關(guān)系為：溫度＞加酶量＞時間＞pH，得出米糠淀粉糖化的最佳工藝參數(shù)為A4B2C1D4，即加酶量為 200 u／g，溫度為 60℃，pH 4．0，時間為6 h。在最佳理論工藝基礎(chǔ)上進行了驗證性試驗，得到DE值為98．96%。

從表8方差分析表可以看出，糖化溫度對米糠淀粉糖化度影響極顯著，糖化加酶量對米糠淀粉糖化度影響顯著；糖化時間和pH對米糠淀粉糖化度影響不顯著。由于糖化酶專一性相比而言比較低，糖化過程中伴隨著復(fù)雜的糖苷鍵的水解和結(jié)合，因此糖化過程需要穩(wěn)定的反應(yīng)溫度，所以溫度的影響最大，其次才是加酶量，pH和時間影響則較小。這與劉建黨等［18］的試驗結(jié)果相吻合。

在方差分析的基礎(chǔ)上進一步對A因素和B因素進行多重比較，由表9可知，在0．05水平下，A因素第4水平和第3水平，第3水平和第2水平之間差異不顯著，第2水平和第1水平之間差異顯著，B因素和A因素差異顯著情況相同；在0．01水平下，A因素水平4和3、3和2、2和1之間的差異均不顯著，B因素水平2和1、1和3之間差異不顯著，水平3和4之間差異顯著。

表9 糖化正交結(jié)果多重比較表（Duncans新復(fù)極差法）

3 討論與結(jié)論

雙酶法提取米糠淀粉，以水解DE值為指標(biāo)，試驗結(jié)果表明：

米糠淀粉液化過程，在單因素基礎(chǔ)上通過正交優(yōu)化得出米糠淀粉液化最佳工藝為：加酶量為16 u／g，溫度為60℃，CaCl2添加量0．2%；DE值為24．31%。其中，加酶量和溫度對米糠淀粉液化度影響極顯著，CaCl2添加量對米糠淀粉液化度影響不顯著。

米糠淀粉糖化過程，在單因素基礎(chǔ)上通過正交優(yōu)化得出糖化最佳工藝為：加酶量為200 u／g，溫度為60℃，pH 4．0，時間為 6 h；DE值為 98．96%。其中，糖化溫度對米糠淀粉糖化度影響極顯著，糖化加酶量對米糠淀粉糖化度影響顯著；糖化時間和pH對米糠淀粉糖化度影響不顯著。

本試驗采用淀粉酶和糖化酶兩種酶對米糠淀粉進行水解工藝研究，米糠粗淀粉的轉(zhuǎn)化率達到了89%，通過查閱一些文獻發(fā)現(xiàn)，目前使用酶法提取淀粉，其產(chǎn)物得率有較大差異，原因是原料性質(zhì)不同，淀粉結(jié)構(gòu)及存在形式也有較大差異［18，25－26］，使得酶作用的效果不一，影響了結(jié)果。米糠中含有大量的纖維素等物質(zhì)，一定程度上影響了淀粉的水解和轉(zhuǎn)化，因此，提高米糠淀粉的轉(zhuǎn)化率水解工藝還有待進一步深入研究。

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