霍成龍，劉國清，鄧小峰，何 杰，苗雄鷹，熊 力*

(1．中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院普外科，湖南 長沙410011;2．長沙市八醫(yī)院東院120，湖南 長沙410011)

胃癌目前是全球發(fā)病率第四位的惡性腫瘤，在腫瘤中致死率居第二位。我國是胃癌高發(fā)國家，每年新發(fā)病例占全球的40%［1］，且早期胃癌診斷率低，大部分胃癌病人出現(xiàn)癥狀時，已是胃癌中晚期，許多已失去了手術(shù)的機(jī)會。為提高晚期病人的生活質(zhì)量和延長病人生命，迫切需要一種對正常組織危害小，全身副反應(yīng)少的治療。

光動力學(xué)療法(photodynamic therapy，PDT)是一種新型腫瘤治療技術(shù)，它們能夠選擇性的殺死腫瘤細(xì)胞，減小對正常組織的危害［2］。作為一種冷光化學(xué)反應(yīng)，它主要依賴于光敏劑和光(常用激光)的相互作用，同時受組織內(nèi)氧濃度影響，因而光敏劑是影響PDT作用效果的重要因素［3］。

與常規(guī)光敏劑相比較，納米光敏劑具有顆粒小、比表面積大、表面反應(yīng)活性高、活性中心多、催化效率高、吸附能力強(qiáng)等特點(diǎn)，制成導(dǎo)向藥物，可達(dá)到靶向輸藥至特定器官的目的［4，5］。

本實(shí)驗(yàn)通過研究比較空心二氧化硅納米微球包裹的photosan和普通photosan對人胃腺癌細(xì)胞AGS的增殖抑制率和殺傷機(jī)制，來評價納米化-photosan的優(yōu)勢，為光敏劑的研究提供進(jìn)一步的理論支持。

1 材料和方法

1．1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1．1．1 細(xì)胞系 人胃腺癌細(xì)胞株AGS購自中南大學(xué)湘雅細(xì)胞庫。

1．1．2 試劑與儀器 原硅酸四乙酯(TEOS，99．99%)，聚丙烯酸(PAA，M．W=3000)，聚丙烯酸鈉(PAAS，M．W=45000)，以上試劑購自阿拉丁化學(xué)有限公司(上海)。無水乙醇(99．7%)，氨，阿摩尼亞(25-28%)，購自中國醫(yī)藥集團(tuán)公司。光敏劑Photosan(一種血卟啉寡聚體混合物)粉末，購自德國Diolitec藥廠，DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco Invitrogen公司。MTT試劑購自sigma公司。LD-630半導(dǎo)體激光機(jī)光動力儀是由深圳雷邁公司提供。

1．1．3 制備空心二氧化硅納米微球包裹的photosan具體簡要步驟 在室溫下，通過單段潮濕法制備包含光敏劑的納米顆粒，即用0．165 mg聚丙烯酸(或者聚丙烯酸)和1 mg的Photosan溶解在4 mL的氨中，然后快速添加100 mL無水乙醇，在避光出充分?jǐn)嚢杈鶆?大概0．5 h)。然后，在10 h內(nèi)將1．395 g原硅酸四乙酯緩慢的添加到里面。每間隔2 h在電磁攪拌器攪拌一次。充分反應(yīng)后，用離心機(jī)分離，用去離子水和無水乙醇洗滌三次，在真空干燥箱中用60℃烘干備用。

1．2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

1．2．1 細(xì)胞培養(yǎng) 人胃腺癌細(xì)胞AGS在含10%胎牛血清的DEME高糖培養(yǎng)液，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取指數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1．2．2 納米化-photosan和普通photosan處理細(xì)胞 人胃腺癌細(xì)胞AGS用0．25%胰酶消化，制備成濃度為2*105個/ml細(xì)胞懸浮液。以每孔200μL體積接種于96孔培養(yǎng)板中，每行接種6個孔，共6行，然后將培養(yǎng)板移入CO2恒溫培養(yǎng)箱中，37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)對照組(既不光照也不加光敏劑)，單純光敏劑組(只加不同劑量的光敏劑，不行光照)，單純光照組(不加光敏劑，只進(jìn)行不同劑量的光照)，實(shí)驗(yàn)組(既加光敏劑也行光照)。將納米化photosan顆粒懸液用不含血清的培養(yǎng)基稀釋成濃度為20 mg/L，15 mg/L，10 mg/L，5 mg/L，2．5 mg/L的溶液。棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS將細(xì)胞洗滌兩遍，然后避光下加入含有納米顆粒的培基200μL在37℃、5%CO2及飽和濕度條件下孵育4 h。4 h后，避光下棄去含納米-photosan的培基，PBS洗滌兩遍。然后，加入200μL普通培基。用630 nm的波長照射細(xì)胞，光照劑量分別為2 J/cm2，4 J/cm2，6 J/cm2。同樣步驟使用普通光敏劑photosan處理細(xì)胞。

1．3 納米化-photosan和普通photosan對細(xì)胞增殖影響的檢測

1．3．1 MTT法檢測 處理后的細(xì)胞繼續(xù)孵育24 h后，每孔加入20μL MTT，孵育4 h后，棄去各孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔中加入150μL DMSO，并于一空白孔中加入150μL DMSO作為調(diào)零標(biāo)準(zhǔn);于振蕩器上振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測儀上選擇570 nm波長測定各孔OD值，記錄結(jié)果。細(xì)胞生存率=實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值×100%

1．3．2 流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡率 基于MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇光照濃度為4 J/cm2，藥物濃度為10 mg/L的條件處理細(xì)胞。收集各組細(xì)胞行細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞術(shù)檢測方法:使用Annexin V-FITC＆PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Biouniquer公司)檢測。按試劑盒的使用說明操作。

2 統(tǒng)計分析

以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果用SPSS19．0統(tǒng)計，所有結(jié)果以用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3．1 納米化-photosan和普通photosan對AGS細(xì)胞MTT檢測結(jié)果

sPDT后AGS細(xì)胞增殖明顯受到抑制，在一定范圍內(nèi)，隨著光照劑量和光敏劑濃度的增加，人胃腺癌細(xì)胞AGS的細(xì)胞生存率明顯下降(P＜0．05)，當(dāng)光照劑量達(dá)到一定程度(4 J/cm2)，增加光照劑量，納米化-photosan實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞生存率不再降低(P＞0．05，圖1)。當(dāng)納米化-photosan光敏劑達(dá)到一定濃度后(10 mg/L)，增加納米化-photosan光敏劑的濃度，細(xì)胞生存率不再降低(P＞0．05，圖2)。

圖1 光敏劑濃度為10 mg/L時，AGS細(xì)胞生存率的比較(*代表P＜0．05，#代表P＞0．05)Fig．1 Photosensitizer concentration of 10 mg/L，comparison about AGScell survival

3．2 納米化-photosan和普通photosan對AGS細(xì)胞凋亡的影響

在實(shí)驗(yàn)參數(shù)(光照強(qiáng)度4 J/cm2，光敏劑劑量為10 mg/L)條件下，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的凋亡率，F(xiàn)ITC/PI雙染流式圖說明:PDT治療后，納米化光敏劑和普通光敏劑均發(fā)生了細(xì)胞凋亡，其中納米化photosan實(shí)驗(yàn)組發(fā)生凋亡(69．15%)明顯高于普通photosan(15．32%)，見圖3。

4 討論

眾所周知，光敏劑被腫瘤組織選擇性吸收是光動力治療的關(guān)鍵。但目前臨床使用較多的光敏劑如血卟啉衍生物等卟啉類藥物存在著一些缺點(diǎn)，最主要的是其最大吸收波長不在對人體組織透過率較佳的紅光區(qū)，藥效不盡理想，且皮膚光毒性大等，因而臨床應(yīng)用受到限制［6］。相比光敏劑的開發(fā)困難，各種類型光動力儀的開發(fā)則容易很多。因此，PDT未來的發(fā)展步伐極大程度上取決于光敏劑的研究進(jìn)度。

圖2 光照強(qiáng)度為4 J/cm2時，AGS細(xì)胞生存率的比較(*代表P＜0．05，#代表P＞0．05)Fig．2 Light dose for 4 J/cm2，comparison about AGS cell survival

由于大部分的光敏劑具有疏水性，這導(dǎo)致了兩個不可避免的問題:1．藥物在血液中的運(yùn)輸2．由于光敏劑的聚集導(dǎo)致較低的光物理性能，減少的光動力治療的效果。因此，必須在體內(nèi)通過某種轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)把光敏劑送到治療部位，這種轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)要求簡單但是有足夠的效率實(shí)現(xiàn)高選擇性，高光動力效應(yīng)，并且有較低的副作用［7，8］。

介孔二氧化硅納米粒子(mesoporous silica nanoparticles，簡稱MSNs)作為納米藥物載體具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和顯著的性能:巨大的比表面積(＞900 m2·g-1)和孔體積(＞1 cm3·g-1)，規(guī)整的孔道，可調(diào)的孔徑(2-10 nm)，易于修飾的內(nèi)外表面［9］。尤其是近些年來，MSNs的表面修飾及功能化取得了突破性進(jìn)展:利用官能化的納米粒子、高分子、蛋白質(zhì)等作為“門衛(wèi)”(Gatekeepers)來控制藥物釋放，顯著表明MSNs在生物技術(shù)和生物醫(yī)藥等方面有許多潛在的應(yīng)用價值［10］。

圖3 流式結(jié)果Fig．3 The results of FCM test

Photosan是光動力治療的經(jīng)典光敏劑，由于硅基納米分子具有獨(dú)一無二的優(yōu)勢，如體積小并且孔隙均勻，具有無毒性和生物相容性，已經(jīng)廣泛的成為藥物和基因載體的一種有效手段［11-14］我們以二氧化硅納米顆粒作為載體，合成性質(zhì)穩(wěn)定并且具有組織相容性的新型納米化光敏劑。多孔二氧化硅納米粒子的結(jié)構(gòu)不僅能作為疏水光敏劑的一個合適載體，并且氧氣和生成的單態(tài)氧能夠輕易滲透。這對光動力治療是必須的［11，15］更重要的。而且，與傳統(tǒng)的運(yùn)載系統(tǒng)不同，以二氧化硅作為載體的光敏劑不需釋放運(yùn)載的藥物［16］。

通過MTT測定AGS細(xì)胞的生存率，與普通photosan相比，納米化-photosan殺傷細(xì)胞的作用更強(qiáng)。經(jīng)光照后，超過一半的AGS細(xì)胞在普通photosan或納米化-photosan濃度低至5 mg/L和10 mg/L被殺死。熊小強(qiáng)等［17］制備了聚乳酸一羥基乙酸共聚物(polylactide-co-glycolide，PLGA)包 裹meta-四-(間 羥基苯基)二氫卟吩［meta(tetrahydroxyphenyl)chlorin，m-THPC］的納米型光敏劑，并在體外研究其對人肝癌細(xì)胞光動力治療作用，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)納米化的光敏劑對肝癌細(xì)胞的殺傷能力高于普通光敏劑。光敏劑納米化改善了普通光敏劑的光化學(xué)效能，提高了其水溶性，增加了腫瘤組織內(nèi)有效光敏藥物的濃度，從而提高腫瘤細(xì)胞的光動力治療的效果。

5 結(jié)論

總之，納米化-photosan和普通photosan均能殺傷細(xì)胞，納米化的-photosan比普通photosan的殺傷作用要強(qiáng)。這說明將光敏劑固定在二氧化硅里，能夠產(chǎn)生光學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，并且治療效率高的光敏劑。更重要的是，提高了光敏劑在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)效率。對于PDT治療腫瘤，這可能代表一個創(chuàng)新的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。

［1］ FERLAY J，SHIN H，BRAY F，et al．Estimates of worldwide burden ofcancer in 2008:GLOBOCAN 2008［J］．Int JCancer，2010，127(12):2893-2917．

［2］ LI Weina，YANG Jiqing，LIU Yuansheng，et al．Photodynamic therapy and sonodynamic therapy［J］．Chinese Journal of Medical Physics，27(2):1781-1784．

［3］ SHAO HONGXIA，LIU RONG，WU QI，et al．Role of photosensitizer in photodynamic therapy［J］．Medical Recapitulate，2008，14(22):3404-3407．

［4］ ZHI PX，QINGH Z，GAOQL．Inorganic nanoparticles as carriers for efficient cellular delivery［J］．Chemical Engineering Science，2006，61(3):1027-1040．

［5］ ZHANGHaixia，WANGJiexin，LE Yuan．Review of liquid controlled precipitation process for preparation of pharmaceutical nano-/microparticles［J］．Journal of Chemical Industry and Engineering(China)，2010，61(7):1720-1733．

［6］ PATRIAIA A，KRISTIAN B，KEITH A CENGEL，et al．Photodynamic therapy of cancer:An update［J］．CA Cancer J Clin，2011，61:250-281．

［7］ Y N KONAN，R GURNY E ALLEMANN．State of the art in the delivery of photosensitizers for photodynamic therapy．［J］Photochem Photobiol B，2002，66(2):89-106．

［8］ M SONCIN，L POLO，E REDDI，et al．Rodgers:Effect of the delivery system on the biodistribution of Ge(IV)octabutoxyphthalocyanines in tumour-bearing mice［J］．Cancer Lett，1995，89(1):101-106．

［9］ LAI C Y，TREWYN B G，JEFTINIJA D M，et al．A mesoporous silica nanosphere-based carriersystem with chemically removable CdS nanoparticle caps for stimuli-responsive controlled release of neurotransmitters and drug molecules［J］．JAm Chem Soc，2003，125(15):4451-4459．

［10］ SLOWING I I，VIVERO-ESCOTO JL，WU CW，et al．Mesoporous silica nanoparticles as controlled release drug delivery and gene transfection carriers［J］．Adv Drug Deliv Rev，2008，60(11):1278-1288．

［11］ I ROY，T Y OHULCHANSKYY，H E PUDAVAR，et al．Ceramic-based nanoparticles entrapping water-insoluble photosensitizing anticancer drugs:a novel drug-carrier system for photodynamic therapy［J］．Am Chem Soc，2003，125(26):7860-7865．

［12］ D BREVET，M GARY-BOBO，L RAEHM，et al．Mannosetargeted mesoporous silica nanoparticles for photodynamic therapy［J］．Chem Commun，2009，12:1475-1477．

［13］ S H Cheng，CH Lee，CSYang，et al．Mesoporous silica nanoparticles functionalized with an oxygen-sensing probe for cell photodynamic therapy:potential cancer theranostics［J］．Mater Chem，2009，19(9):1252-1257．

［14］ H L TU，Y SLIN，H Y LIN，et al．In vitrostudies of functionalized mesoporous silica nanoparticles for photodynamic therapy［J］．Adv Mater，2009，21(2):172-177．

［15］ D BECHET，P COULEAUD，C FROCHOT，et al．Barberi-Heyob:Nanoparticles as vehicles for delivery of photodynamic therapy agents［J］．Trends Biotechnol，2008，26(11):612-621．

［16］ JW SNYDER，E SKOVSEN，JD LAMBERT，et al．Subcellular，time-resolved studies of singlet oxygen in single cells［J］．Am Chem Soc，2005，127(42):14558-14559．

［17］ 熊小強(qiáng)，陳汝福，汪峰，等．PLGA-m-THPC納米型光敏劑的制備及其光動力治療肝癌細(xì)胞的研究［J］．中華普通外科學(xué)文獻(xiàn)，2008，12(6):460-464．XIONG Xiaoqiang，CHEN Rufu，WANG Feng，et al．Production of PLGA-m-THPC nanoparticles and it’s photodynamic therapy on human hepatic cancer cell［J］．Chinese Archives of General Surgery，2008，12(6):460-464．