劉桂華，姚天明，柳 悅，謝 利，黃杉生

（上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海201418）

TiO2/Au復(fù)合膜酪氨酸酶修飾傳感器檢測雙酚A

劉桂華，姚天明，柳 悅，謝 利，黃杉生*

（上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海201418）

基于TiO2和金納米粒子研制了一種新型雙酚A酶生物傳感器。研究表明金納米粒子與具有生物相容性的納米TiO2組合，可有效的保持酶的生物活性，具有協(xié)同效應(yīng)。制備的TiO2/Au復(fù)合膜酪氨酸酶修飾傳感器對環(huán)境雌激素雙酚A（BPA）的靈敏、快速的電流響應(yīng)。該傳感器對BPA的響應(yīng)的線性范圍為2×10-7～2.8×10-6mol/L，檢測限為5×10-8mol/L(S/N=3)。電極用于實(shí)際樣品的測定，結(jié)果滿意。

金納米粒子；酪氨酸酶；二氧化鈦；雙酚A；酶生物傳感器

0 引言

酚類環(huán)境雌激素指的是那些具有類雌激素活性，且同時(shí)具備酚類結(jié)構(gòu)的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物[1~2]，已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)的主要有雙酚A(BPA)、辛基酚、壬基酚、和2,4-二氯苯酚[3]等。由于環(huán)境雌激素對人類及其他哺乳動物的內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生嚴(yán)重的影響，具有一定程度的毒性作用[4]，尤其是其中具有致癌，致畸，致變 “三致”潛在危險(xiǎn)的BPA[5]，它不僅大量地存在于自然環(huán)境中[6]，同時(shí)作為工業(yè)生產(chǎn)中廣泛使用的原材料，與人類的工作和生活緊密相關(guān)[7]，因此建立快速、準(zhǔn)確及可靠地測定BPA的方法意義深刻[8]。

金屬氧化物納米粒子和金屬納米粒子都已越來越廣泛地用來修飾電極。在大量的新型納米材料之中，TiO2因?yàn)樵谧贤夤庹丈湎驴梢源呋到獠糠钟袡C(jī)污染物而廣泛受到關(guān)注。實(shí)驗(yàn)室可制備多種形態(tài)的納米TiO2，如：納米粒子[9]、納米纖維[10]和納米管[11]等。作為一種半導(dǎo)體材料納米TiO2，有著良好的電子傳導(dǎo)能力，大的比表面積，催化降解效應(yīng)和生物相容性，在現(xiàn)今各種形態(tài)的TiO2都被用來作為電極的修飾材料制備生物傳感器[12~15]。

金納米粒子（AuNPs）作為被最頻繁使用和最廣泛研究的一種納米材料，也大量的在構(gòu)建生物傳感器時(shí)使用。其出色的電子傳遞能力和極佳的生物相容性都為大眾熟知，這些特性使得金納米粒子可以構(gòu)建出色，穩(wěn)定且保持酶活性的固載界面。但小顆粒的物質(zhì)在水相中十分容易團(tuán)聚在一起，從而導(dǎo)致各種性能的降低。在該工作中，納米金粒子和TiO2通過殼聚糖被均勻分散，TiO2的存在可以有效地防止金納米粒子發(fā)生團(tuán)聚。而且二者都具有良好的生物相容性，結(jié)合在一起能有效的保持酶的生物活性，發(fā)揮良好的協(xié)同作用。研制的TiO2/Au復(fù)合膜酪氨酸酶修飾傳感器用于環(huán)境雌激素雙酚A（BPA）的檢測，具有令人滿意的靈敏度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑與儀器

酪氨酸酶 （Tyr,5370 U/mg，Sigma公司，美國），雙酚A(BPA，成都化工有限公司)，殼聚糖(Chits)、氯金酸（HAuCl4）購于上?；瘜W(xué)試劑有限公司；[Fe(CN)6]4-/3-溶液由定量的鐵氰化鉀，亞鐵氰化鉀和氯化鉀配制；磷酸鹽緩沖溶液由0.1 mol/L的NaH2PO4，Na2HPO4和KCl調(diào)配而成；以上使用試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q系統(tǒng)制備的超純水（＞18 MΩ·cm）。

電化學(xué)實(shí)驗(yàn)均在CHI 760 C型電化學(xué)工作站（上海辰華儀器有限公司）上進(jìn)行。采用三電極系統(tǒng)，修飾電極為工作電極，鉑電極為對電極，甘汞電極為參比電極。紫外-可見（UV-Vis）光譜實(shí)驗(yàn)采用UV-2100型紫外-可見分光光度計(jì)（上海優(yōu)尼科儀器有限公司）；場發(fā)射掃描電子顯微鏡（FESEM）圖由Hitachi S-4800型掃描電鏡得到；透射電子顯微鏡（TEM）圖由JEOL-JEM200CX型透射電鏡得到。

1.2 TiO2材料制備

0.160 0 g四氟化鈦（TiF4）粉末準(zhǔn)確加入到40 mL叔丁醇中，等到TiF4粉末完全溶解后，轉(zhuǎn)移到50 mL的水熱釜中，放入160℃烘箱3 d。得到的白色粉體經(jīng)乙醇洗滌、4 000 r/min離心3次，放入100℃的烘箱下烘干，最后在設(shè)定溫度下焙燒2 h。升溫速率為2℃/min。Au納米材料的制備按文獻(xiàn)所述方法制備[16]。

1.3 電極的表面處理與修飾

玻碳（GCE）電極分別用1.0、0.3、0.05 mm的氧化鋁粉末在麂皮上打磨拋光，直至產(chǎn)生一個光亮、平滑的表面。電極分別置于超純水，無水乙醇、超純水里超聲清洗3 min后，用氮?dú)鈱⑵浔砻娲蹈?。?μL含有1:1的金溶膠和2 mg/mL的TiO2殼聚糖（w=0.5%）溶液滴加到上述已經(jīng)處理好的光潔的電極表面，放入干燥器中，形成一層TiO2/Au薄膜。隨后取2 μL的酪氨酸酶（2 mg/mL）滴加到處理好的電極表面，置于冰箱4℃保存待用。所制備的電極標(biāo)記為Tyr/Au-TiO2/chits/GCE。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 材料表征

采用場發(fā)射掃描顯微鏡對合成的TiO2納米粒子進(jìn)行了表征（圖1a），得到的TiO2表面粗糙，且存在許多空穴，具有較大的比表面積。圖1b為金納米粒子透射電子顯微鏡圖，由圖可見，金納米粒子的粒徑約為8～20 nm。小粒徑的AuNPs可以容易的分布在TiO2表面的空穴中，有利于二者結(jié)合發(fā)揮協(xié)同作用。

圖1 (a)TiO2場發(fā)射掃描顯微鏡圖和(b)AuNPs的透射電鏡圖Fig.1 FESEM image of TiO2（a）and TEM image of AuNPs(b)

2.2 電化學(xué)行為表征

循環(huán)伏安法（CV）是一種表征電子傳遞能力電化學(xué)檢測方法，可以明顯的表征電極是否修飾成功。圖2是修飾電極制備過程在[Fe(CN)6]4-/3-溶液中的CV圖。

圖2 (a)裸GCE和(b)TiO2-Au/chits/GCE,(c)Tyr/TiO2-Au/chits/GCE在1 mmol/L[Fe(CN)6]4-/3-（0.1 mol/L KCl）溶液中的循環(huán)伏安曲線Fig.2 CVs of GCE(a),TiO2-Au/chits/GCE(b),and Tyr/TiO2-Au/chits/GCE(c)in 1mmol/L[Fe(CN)6]4-/3-containing 0.1 mol/L KCl

由圖2可見，裸GCE(a)在[Fe(CN)6]4-/3-溶液中呈現(xiàn)出一對良好峰形的準(zhǔn)可逆氧化還原峰 （圖2曲線a）。在其表面修飾了金溶膠和2 mg/mL的TiO2殼聚糖后，TiO2-Au/chits/GCE的峰電流有略微降低(圖2曲線b)，這說明電極表面TiO2-Au修飾成功，TiO2-Au層的存在部分占據(jù)了GCE表面的導(dǎo)電位點(diǎn)。當(dāng)在TiO2-Au/chits/GCE上修飾了酪氨酸酶Tyr后，Tyr/TiO2-Au/chits/GCE的峰電流明顯變小(圖2曲線c)，因?yàn)樯镔|(zhì)Tyr導(dǎo)電性比較差，也表明了Tyr成功的組裝到了修飾電極上。

2.3 電化學(xué)交流阻抗表征

用交流阻抗法（EIS）表征了電極在修飾過程中的交流阻抗曲線（圖3）。曲線(a)是裸GCE電極的交流阻抗曲線，由圖可知在所有的頻率范圍內(nèi)都近乎是一條直線。圖中的(b)和(c)分別對應(yīng)TiO2-Au/chits/GCE和 Tyr/TiO2-Au/chits/GCE的交流阻抗曲線。可以發(fā)現(xiàn)隨著修飾層數(shù)的增加，TiO2-Au/chits的存在使得[Fe(CN)6]4-/3-在電極表面的電子轉(zhuǎn)移阻力增大（b）。當(dāng)電極修飾了Tyr后的阻抗圖，阻抗半圓明顯增大(c)，說明生命物質(zhì)Tyr的存在更加大了電極表面電子轉(zhuǎn)移的阻力。EIS的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與CV表征的結(jié)果高度一致，因此，可以認(rèn)為用此法成功制備了Tyr/TiO2-Au/chits/GCE電極。

圖3 GCE(a)，TiO2-Au/chits/GCE(b),和Tyr/TiO2-Au/chits/GCE(c)在10 mmol/L[Fe(CN)6]4-/3-（0.1 mol/L KCl）溶液中的交流阻抗圖Fig.3 EIS of GCE(a)TiO2-Au/chits/GCE(b)and Tyr/TiO2-Au/chits/GCE(c)in 10 mmol/L[Fe(CN)6]4-/3-containing 0.1 mol/L KCl

2.4 修飾電極BPA的響應(yīng)

在含5.0×10-5mol/L BPA的PBS(pH=8.0)溶液中，裸GCE、TiO2-Au/chits/GCE和Tyr/TiO2-Au/ chits/GCE的循環(huán)伏安響應(yīng)，見圖4。GCE（a）和TiO2-Au/chits/GCE（b）沒有明顯的氧化還原峰，而Tyr/TiO2-Au/chits/GCE（c）在0.15 V處出現(xiàn)一個明顯的氧化峰，說明在修飾了酪氨酸酶（Tyr）存在情況下電極對BPA有顯著的響應(yīng)。

2.5 溶液pH的影響

圖5 Tyr/TiO2-Au/chits/GCE在pH值為5.0,6.0,7.0,8.0和9.0 PBS中循環(huán)伏安曲線。內(nèi)插圖：pH值與氧化電位E0x的線性關(guān)系。掃速:100 mV/sFig.5 Effect of pH value of medium on CVs of Tyr/TiO2-Au/chits/GCE Inset:plot of potential versus the pH. Scan rate:100 mV/s

酶的活性對酶生物傳感器至關(guān)重要，其中溶液的pH值對酶活性影響直接會導(dǎo)致電化學(xué)行為變化。通常，氧化還原的電位與溶液的pH值有關(guān)。圖5為Tyr/TiO2-Au/chits/GCE在不同pH值PBS中的循環(huán)伏安曲線。從圖上可以看到在pH值5.0~9.0之間，Tyr都有催化BPA所產(chǎn)生的氧化峰，且隨著pH值的增大，氧化峰電位發(fā)生正移。并且其氧化峰的電位與溶液的pH值成線性關(guān)系（左上插圖），線性的斜率為-51.8 mV/pH（r= 0.995 0）。接近-57.6 mV/pH的理論單質(zhì)子轉(zhuǎn)移的電極反應(yīng)。選擇pH=8為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的溶液條件。

2.6 掃描速度對循環(huán)伏安特性的影響

圖6是Tyr/TiO2-Au/chits/GCE不同掃速的循環(huán)伏安曲線。從圖中可以發(fā)現(xiàn)，氧化峰電流隨著掃速的增加而增加，并且在掃速50~250 mV/s范圍內(nèi)，氧化峰的峰電位基本不變，且氧化峰電流與掃速成線性關(guān)系。線性關(guān)系如左上插圖所示，表明Tyr催化BPA這一反應(yīng)是表面控制的電極反應(yīng)過程，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。同時(shí)這也表明修飾材料及Tyr都已固定到了電極上，并伴隨有電子轉(zhuǎn)移。

2.7 計(jì)時(shí)庫侖法

電極有效表面積可以對計(jì)時(shí)庫侖法圖（如圖7所示），通過Anson[17]公式從Q與t1/2的線性關(guān)系計(jì)算得到：

式中，A是工作電極的有效表面積，c是物質(zhì)的濃度，D是擴(kuò)散系數(shù)，Qdl是能通過背景物質(zhì)估算的雙層電荷，Qads為法拉第電荷。其他符號都是常數(shù)?；赒和t1/2之間的斜率關(guān)系，當(dāng)c，D和n都知道時(shí)，A能被計(jì)算出來。計(jì)時(shí)庫侖法實(shí)驗(yàn)是在含有1 mmol/L KCl的0.1mmol/L K3[Fe(CN)6]溶液中進(jìn)行的（圖7）。K3[Fe(CN)6]的擴(kuò)散系數(shù)是7.6×10-6cm2/s[17]。由此可以計(jì)算出電極的有效表面積A為 0.000 81 cm2(裸GCE)和0.002 90 cm2(Tyr/TiO2-Au/chits/GCE)。通過比較電極在修飾前后有效表面積的變化，發(fā)現(xiàn)Tyr/TiO2-Au/chits/GCE有更好的有效表面積，幾乎是裸GCE的4倍。說明Tyr/TiO2-Au/chits/GCE可以提供更多的有效位點(diǎn)，從而提高響應(yīng)信號。

圖6 Tyr/TiO2-Au/chits/GCE在PBS(pH=8.0)中不同掃速的循環(huán)伏安曲線：50,100,150,200,250 mV/s（從內(nèi)至外）。內(nèi)插圖：峰電流與掃速的線性關(guān)系Fig.6 Effect of scan rate on CVs of Tyr/TiO2-Au/chits/GCE in PBS(pH8.0)Inset:plot of peak current versus scan rate

圖7 裸GCE（a）和Tyr/TiO2-Au/chits/GCE（b）在0.1 mmol/L K3[Fe(CN)6]（1 mmol/L KCl）的Q-t曲線插圖：（a）裸GCE和（b）Tyr/TiO2-Au/chits/GCE的Q與t1/2的線性關(guān)系Fig.7 Plot of Q and t1/2of(a)bare GCE and(b)Tyr/TiO2-Au/chits/GCE in 0.1 mmol/L K3[Fe(CN)6]solution containing 1 mmol/L KCl.Inset:Relationship of Q and t1/2of(a)bare GCE and(b)Tyr/TiO2-Au/chits/GCE

2.8 計(jì)時(shí)電流響應(yīng)

圖8是Tyr/TiO2-Au/chits/GCE在0.2 V的工作電位下，向PBS(pH=8.0)中連續(xù)加入BPA的it曲線。隨著BPA濃度的不斷增加，氧化電流隨之慢慢增加并很快達(dá)到穩(wěn)態(tài)電流。內(nèi)插圖反映了該傳感器在不同BPA濃度下對催化電流的線性校正關(guān)系，Tyr/TiO2-Au/chits/GCE對BPA的檢測濃度范圍為2×10-7~2.8×10-6mol/L，線性相關(guān)系數(shù)r=0.996 7(n=14)，檢測限為5×10-8mol/L（信噪比S/N=3）。

圖8 Tyr/TiO2-Au/chits/GCE在PBS(pH=8.0)中連續(xù)加入BPA的計(jì)時(shí)電流響應(yīng)曲線(工作電位:0.2 V)。右上插圖:響應(yīng)電流與BPA濃度的校正曲線Fig.8 I-T of the Tyr/TiO2-Au/chits/GCE at 0.2 V of successive addition of BPA in a stirred PBS(pH=8.0). Inset:plot of the linear calibration curves

2.9 重現(xiàn)性、穩(wěn)定性、抗干擾性和實(shí)際樣品檢測

用相同制備方法所制備的5支Tyr/TiO2-Au/chits/GCE對同一濃度 BPA溶液 （5.0×10-5mol/L）進(jìn)行測定，所得到電流響應(yīng)值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.26%。修飾電極對同一濃度BPA溶液（5.0×10-5mol/L）連續(xù)測定14 d，14 d后的電流響應(yīng)值仍保持原來的88%以上。表明該修飾電極的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性較好。維持試液中BPA濃度為5.0×10-5mol/L，考察了酚類物質(zhì)，如：2,4,6三氯苯酚，1-亞硝基-2-萘酚，鄰氨苯酚，2,4二氯苯酚，苯酚，鄰氨二甲酸二正辛酯對Tyr/TiO2-Au/chits/ GCE檢測BPA的干擾，發(fā)現(xiàn)1-亞硝基-2-萘酚，鄰氨苯酚，2,4二氯苯酚，鄰氨二甲酸二正辛酯對檢測幾乎不存在干擾，在檢測BPA時(shí)只存在很小的偏差（＜10%）。而2,4,6三氯苯酚和苯酚所產(chǎn)生的峰電位不同于BPA檢測的峰電位。同時(shí)也考察了常見無機(jī)離子如：Na+、Ca2+、Mg2+、Fe3+、Al3+、Zn2+、、和對檢測的干擾，發(fā)現(xiàn)對檢測并不產(chǎn)生影響。說明Tyr/TiO2-Au/chits/GCE有很好的抗干擾能力，對BPA有著很好的選擇性。實(shí)際樣品的檢測和回收率測試結(jié)果列入表1。

表1 樣品檢測及回收率測定Tab.1 Determination of different samples and recovery

3 結(jié)論

研制的Tyr/TiO2-Au/chits/GCE的新型酪氨酸酶傳感器，對BPA有靈敏的電流響應(yīng)，電極的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性良好。為BPA的檢測提供了一個簡單、廉價(jià)、可供選擇的方法。

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Determination of bisphenol A based on nano-TiO2/Au tyrosinase composite biosensor

Liu Gui-hua,Yao Tian-ming,Liu Yue,Xie Li,Huang Shan-sheng*
(Life and Environmental Sciences College,Shanghai Normal University,Shanghai 201418,China)

A novel enzyme biosensor for bisphenol A(BPA)was fabricated based on Au nanoparticles and titanium dioxide nanoparticles (TiO2).The study revealed that the combination of Au nanoparticles and titanium dioxide nanoparticles with biocompatibility showed the synergistic effect on the response of BPA at this electrode,resulting in a highly sensitive,selective,stable,fast response to BPA.The method showed good linearly for 2×10-7～2.8×10-6mol/L BPA with a detection limit of 5×10-8mol/L (S/N=3)under the optimal conditions.The performance of the electrode was verified by the determination of BPA.

Au nanoparticle;tyrosinase;titanium dioxide;bisphenol A;enzyme biosensor

*通訊聯(lián)系人,E-mail:sshuang@shnu.edu.cn