王君霞，何婧琳，曾利紅，伍 娉，朱爽麗，曹 忠

(長沙理工大學化學與生物工程學院，電力與交通材料保護湖南省重點實驗室，湖南長沙410004)

用于腺苷檢測的基于級聯(lián)擴增核酸適體電化學傳感界面的構(gòu)建研究

王君霞，何婧琳*，曾利紅，伍 娉，朱爽麗，曹 忠*

(長沙理工大學化學與生物工程學院，電力與交通材料保護湖南省重點實驗室，湖南長沙410004)

該文報道了一種基于酶級聯(lián)擴增的電化學核酸適體檢測腺苷的新方法。當腺苷存在時，滾環(huán)擴增的引物通過E.coli DNA連接酶的作用與通過巰基組裝在金電極上的固定探針連接。在pHi29 DNA聚合酶的作用下，滾環(huán)擴增反應(yīng)進行并產(chǎn)生一條與環(huán)形探針完全互補的長的單鏈，然后將大量金納米粒子標記的核酸探針與滾環(huán)擴增的產(chǎn)物雜交。該傳感界面電化學行為的結(jié)果表明，通過酶級聯(lián)擴增的方法提高了檢測腺苷的阻抗響應(yīng)靈敏度，且選擇性和重現(xiàn)性良好。用于腺苷的檢測時，其線性范圍為2.0 μmol/L~100 μmol/L，最低檢測濃度為2.0 μmol/L，表明該傳感界面的設(shè)計可作為一種通用方法而有望用于其它目標物的檢測。

傳感界面設(shè)計；核酸適體；工具酶級聯(lián)擴增；電化學阻抗；腺苷

0 引言

核酸適體（Aptamer，源于拉丁語）指的是經(jīng)體外篩選技術(shù)SELEX(指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化)篩選出的能特異結(jié)合蛋白質(zhì)或其他小分子物質(zhì)的寡聚核苷酸片段。近年來，基于核酸適體己發(fā)展了腺苷[1]、可卡因[2]等小分子和凝血酶[3]、溶菌酶[4]等蛋白質(zhì)分子的生物傳感器，在臨床應(yīng)用和基礎(chǔ)研究中發(fā)揮著越來越重要的作用[5]，特別是DNA連接酶反應(yīng)[6~7]和滾環(huán)擴增(rolling circleamplification，RCA)技術(shù)[8~9]以其高特異性和強大的擴增能力受到廣泛關(guān)注。首先，連接酶只能在連接位點催化兩個并列的并且和目標序列匹配的DNA鏈，如果在這兩條DNA鏈和目標DNA鏈中的連接位點堿基不匹配，那么連接反應(yīng)就不能進行[10]，因此，DNA連接酶能很好的提高檢測的特異性。如Wu等[11]結(jié)合連接酶與反向分子信標聯(lián)用，利用二茂鐵靠近電極表面來實現(xiàn)對目標的檢測。其次，滾環(huán)放大體系的核心是噬菌體pHi29 DNA聚合酶，具有持續(xù)合成效率高、性能穩(wěn)定的優(yōu)點，將聚合酶對DNA的特定作用應(yīng)用于核酸探針分析中，極大地提高了檢測靈敏度。如Ellington等將滾環(huán)擴增技術(shù)與核酸適體相結(jié)合，利用核酸適體探針與目標物相結(jié)合導致核酸適體探針的構(gòu)象發(fā)生變化，從而引發(fā)線型掛鎖探針連接成環(huán)后進行滾環(huán)擴增，分別實現(xiàn)了對表皮生長因子PDGF[8]和三磷酸腺苷ATP[9]的放大檢測。

在電化學傳感器的設(shè)計中，用于提高檢測靈敏度的信號放大方法有滾環(huán)放大[12~13]、酶標放大[14]、基于納米材料的信號放大[15~16]、鏈置換信號放大[17~18]及場效應(yīng)晶體管信號放大技術(shù)等[19]，其中采用納米材料放大信號的方法近年來發(fā)展較快，它不需要特別復雜的分子生物學操作，且對目標物檢測具有高靈敏度、高特異性的特點[20]。

該文設(shè)計了一種基于工具酶級聯(lián)擴增核酸（Guanine）、胞嘧啶（Cytosine）和尿嘧啶（Uridine）購自捷瑞生物工程有限公司 （上海）；E.coli DNA連接酶和dNTP購自大連寶生物工程公司；pHi29 DNA聚合酶購自New England Biolabs有限公司；Triton X-100購自生工生物工程 （上海）有限公司；氯金酸購自于國藥集團化學試劑有限公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純，實驗用水為經(jīng)適體電化學傳感界面用于腺苷的檢測。該方法聯(lián)用連接酶和滾環(huán)擴增酶，使腺苷存在下固定于電極上的引物循環(huán)生長，繼而大量自組裝金納米粒子，導致電信號極大增強。該方法利用工具酶的高效性和高保真性，有效地提高了小分子傳感識別的靈敏度、特異性，在分子識別傳感界面構(gòu)建方面具有重要意義。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CHI-660B電化學工作站 （上海辰華儀器公司），Microfuge 22R型臺式微量冷凍離心機（貝克曼庫爾特有限公司，美國），KQ3200B超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器公司），CS501-3C型超級數(shù)顯恒溫器（重慶四達實驗儀器有限公司）。采用三電極體系，工作電極為金電極，參比電極為Ag/AgCl（飽和KCl），對電極為鉑絲電極。

實驗所用核酸適體序列均購自于生工生物工程（上海）有限公司，粗斜體部分表示腺苷核酸適體序列（見表1）。雜交探針、啟動探針、環(huán)形探針和檢測探針均用25 mmol/L Tris-HCl緩沖液（含有 140 mmol/L NaCl和 2 mmol/L MgCl2，pH7.4）溶解和稀釋。將固定探針溶于含有300 mmol/L NaCl和 2 mmol/L MgCl2的 25 mmol/L Tris-HCl溶液（pH7.5）得到濃度為2 μmol/L的固定探針溶液。 腺苷 （Adenosine）、鳥嘌呤過重蒸餾的高純?nèi)ルx子水，配制生物試劑所用水和緩沖溶液均經(jīng)高溫高壓滅菌。

表1 核酸適體探針序列Tab.1 The sequence of aptamer probes

1.2 金納米粒子（AuNPs）的制備與標記

AuNPs采用檸檬酸鈉還原法制備[21]：所用玻璃器皿置于新鮮配置的王水(V(濃鹽酸)∶V(濃硝酸)=l∶3)中浸泡，超純水充分清洗干凈。于99 mL超純水中加入1 mL l%的氯金酸，攪拌加熱至沸騰，然后迅速加入3 mL 1%的檸檬酸鈉，觀察溶液由淡黃色逐漸變?yōu)榉€(wěn)定的紅色，繼續(xù)攪拌1 h，然后冷卻至室溫。將制備好的AuNPs溶液置于棕色玻璃試劑瓶中，4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

AuNPs標記檢測探針具體過程如下[22]：取1 mL AuNPs于3 000 r/min、0℃離心8 min，取上清液加入王水泡過的比色管，分40次向比色管中加入100 μL 20 μmol/L的檢測探針。然后緩慢加入50 μL 200 mmol/L的Tris溶液到比色管中，冷藏放置過夜。繼續(xù)緩慢向比色管中加入50 μL 2 mmol/L的NaCl冷藏放置40 h。最后加入100 μL 5%的Triton X-100，以10 000 r/min、0℃離心10 min，去上清液，下層油狀液在1 mL Tris溶液中避光保存。

1.3 金電極預處理與傳感器制備

首先將半徑為1 mm的金電極依次用0.3 μm、0.05 μm的Al2O3粉拋光10 min，依次用去離子水、無水乙醇、去離子水超生清洗10 min，然后放置在Piranha溶液（H2O2∶H2SO4=3∶7）中浸泡20 min，最后在0.1 mol/L H2SO4溶液中進行循環(huán)伏安（CV）掃描，電位范圍為-0.3~1.55 V。

在預處理過的金電極上滴加15 μL 2 μmol/L固定探針冷藏孵育12 h，用1 mmol/L巰基乙醇封閉6 min。輕柔沖洗未反應(yīng)的探針和巰基乙醇后，電極分別在含有2 μmol/L雜交探針、特定濃度的腺苷、10 μmol/L啟動探針及1 μL E.coli DNA連接酶混合液中恒溫37℃培育80 min。電極表面依次滴加2.5 μmol/L環(huán)形探針、2.5 mmol/L dNTP及0.2 μL pHi29 DNA聚合酶，于37℃恒溫孵育2 h。最后將15 μL標記好AuNPs的檢測探針滴加在電極上于18℃孵育1 h，再進行電化學檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 傳感探針界面設(shè)計與機理探討

傳感探針界面設(shè)計如圖1所示。固定探針借助Au-S鍵作用自組裝到金電極表面。雜交探針在腺苷的作用下開環(huán)與固定探針及腺苷分子形成復合物。啟動探針與雜交探針部分雜交，在連接酶的作用下切口撫平，啟動探針連接于電極表面。由于啟動探針的3’端部分序列與環(huán)形探針雜交，加入滾環(huán)擴增酶，啟動探針以環(huán)形探針為模板不斷復制延長。然后加入標記AuNPs的核酸短鏈，該核酸短鏈能與滾環(huán)擴增生長得到的長鏈雜交，至此，電化學傳感界面上由于腺苷分子的存在聚集了大量的金納米粒子，實現(xiàn)傳感器阻抗信號的增大。若傳感界面沒有腺苷分子出現(xiàn)，雜交探針不會開環(huán)，工具酶級聯(lián)擴增反應(yīng)和AuNPs的自組裝皆不能發(fā)生。

圖1 用于腺苷檢測的工具酶級聯(lián)擴增核酸適體電化學傳感界面設(shè)計示意圖Fig.1 Schematic diagram for design of an enzyme cascade amplification based electrochemical aptamer sensing interface which is used for adenosine detection

傳感探針界面上實現(xiàn)腺苷檢測的關(guān)鍵之處在于腺苷識別元件的設(shè)計，腺苷的結(jié)合位點分別在固定探針的3’端和雜交探針的3’端，在沒有腺苷存在時，雜交探針的兩端互相雜交形成發(fā)夾型的二級結(jié)構(gòu)，不能與組裝在金電極上的固定探針結(jié)合。因此，金電極上始終只組裝有固定探針，電化學信號沒有明顯變化。而當腺苷存在時，雜交探針的發(fā)卡型結(jié)構(gòu)打開，并與固定探針的3’端雜交，同時將腺苷包裹其中，于是，雜交探針成功組裝到金電極上，為后續(xù)組裝的信號放大提供了可能。該傳感探針界面設(shè)計采用了滾環(huán)擴增方法（RCA）和向金電極上組裝上大量AuNPs來實現(xiàn)對電化學信號的放大。在RCA反應(yīng)中，短的環(huán)型單鏈DNA作為DNA聚合酶的模板，在dNTP存在下，產(chǎn)生大量的、與環(huán)形探針互補的單鏈DNA長鏈，在該長鏈上雜交上修飾有AuNPs的核酸短鏈，從而將AuNPs組裝上金電極表面，AuNPs所具有的表面效應(yīng)和體積效應(yīng)使得電極阻抗信號值明顯增加。

所設(shè)計的傳感探針界面的優(yōu)點在于，目標識別和RCA反應(yīng)均直接在傳感界面上進行，省去了傳統(tǒng)操作中先在均相中進行反應(yīng)，然后將反應(yīng)混合液滴加到傳感界面的復雜步驟，具有重要的基礎(chǔ)研究與應(yīng)用價值。

2.2 傳感界面的電化學行為

實驗考察了電化學傳感界面制作過程中電極逐步修飾的交流阻抗（圖2A）和循環(huán)伏安（圖2B）行為。在圖2A中，裸金電極（曲線a）的阻抗值很小，說明預處理過后的金電極傳遞電子能力很強。修飾了固定探針的電極（曲線b）阻抗值略有增加，達到4 000 Ω，說明固定探針已經(jīng)自組裝到金電極表面。電極表面在含有雜交探針、腺苷、啟動探針與連接酶混合液中經(jīng)過連接酶反應(yīng)（曲線c）后，阻抗值繼續(xù)升高至4 700 Ω，說明雜交探針已經(jīng)順利通過腺苷而連接到金電極上。曲線d是金表面經(jīng)過滾環(huán)擴增反應(yīng)后得到的交流阻抗譜，阻抗值為6 500 Ω，說明滾環(huán)擴增反應(yīng)順利進行，電極表面的DNA得以生長延長。標記AuNPs的檢測探針與新生長出來的長鏈雜交后 （曲線e），阻抗譜半徑顯著增加，阻抗值達到14 500 Ω，表明標記AuNPs的檢測探針很好地結(jié)合在電極表面，阻礙了電子的傳遞，實現(xiàn)對腺苷檢測的信號放大作用；其阻抗的變化趨勢也能從相應(yīng)的循環(huán)伏安響應(yīng)行為（圖2B）中得到印證。

2.3 連接酶時間的優(yōu)化

圖2 傳感界面逐步修飾過程的交流阻抗譜（A）與循環(huán)伏安響應(yīng)圖（B）：(a)裸金電極；(b)固定探針修飾電極；(c)連接酶反應(yīng)產(chǎn)物修飾電極；(d)滾環(huán)擴增酶反應(yīng)產(chǎn)物修飾電極；(e)AuNPs標記檢測探針與滾環(huán)擴增酶反應(yīng)產(chǎn)物雜交復合物修飾電極。所有電化學檢測均在含0.1 mol/L KCl的5 mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-溶液中進行Fig.2 Impedance spectra(A)and cyclic voltammogram(B)of the sensing interface with different modification processes.(a)Bare Au electrode;(b)capture probe assembled;(c)E.coli DNA ligase assembled electrode;(d) circular probe assembled;(e)AuNPs labeled probe assembled.All electrochemical test are carried out in 5 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-solutions containing 0.1 mol/L KCl

由于連接酶的反應(yīng)深受孵育時間的影響，考察連接酶的孵育時間對腺苷檢測的影響非常重要。圖3為連接酶孵育時間與相對阻抗信號值的關(guān)系圖，圖中連接酶孵育時間分別為20 min、40 min、60 min、80 min和100 min，Z為有腺苷存在時的阻抗信號值，Z0為沒有腺苷存在時的阻抗信號值。由圖3可見，檢測腺苷的信背比（Z/Z0）隨著連接酶孵育時間的增加而增大，當連接酶的孵育時間為80 min時，對腺苷的檢測信背比達最大值（2.5）。然后，當時間繼續(xù)增加，信背比反而降低。原因是孵育時間超過80 min，背景信號快速上升，導致信背比下降。因此，連接酶的最佳孵育時間選用80 min。

圖3 連接酶孵育時間與相對阻抗信號值關(guān)系圖。Z為腺苷存在時的阻抗信號值，Z0為腺苷不存在時的阻抗信號值Fig.3 Effect on incubation time of E.coli DNA ligase.Z is the impedance value in the presence of adenosine,and Z0isthe impedance value in the absence of adenosine

2.4 特異性的考察

圖4 工具酶級聯(lián)擴增核酸適體傳感方法用于腺苷和三種干擾物質(zhì)（鳥嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶）檢測的信背比柱狀圖Fig.4 Histogram of signal-to-background ratio(Z/Z0)for the enzyme cascade amplification based electrochemical aptamer sensor.Z is the impedance value in the presence of analytes like adenosine,guanine,cytosine,and uridine.And Z0is the impedance value in the buffer solution(as blank)

為了考察該方法對腺苷檢測的特異性，以鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶作為干擾物進行交流阻抗測試（圖4），腺苷和三種同系物的濃度均為100 μmol/L。由結(jié)果可知，該傳感器檢測腺苷的信背比值（Z/Z0）為2.7，而加入鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶體系的信背比值接近1，即加入了鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶的體系幾乎無響應(yīng)信號，即對腺苷的檢測不產(chǎn)生干擾，表明該方法對腺苷有良好的選擇性。

2.5 傳感器的重現(xiàn)性

為了考察該文所發(fā)展的級聯(lián)擴增核酸適體電化學傳感器的重現(xiàn)性性能，將相同實驗條件下制備的3支傳感器分別結(jié)合濃度為100 μmol/L的腺苷樣品，測試結(jié)果見表2，傳感器的電化學阻抗響應(yīng)值的標準偏差為±751 Ω，相對標準偏差為5.47%，表明該電化學傳感器對腺苷的響應(yīng)有良好的重現(xiàn)性。

2.6 腺苷的定量檢測

為了考察該文所發(fā)展的級聯(lián)擴增核酸適體電化學傳感器的定量分析性能，將不同濃度的腺苷加入體系中，進行交流阻抗檢測，實驗結(jié)果如圖5所示。在圖5A中，傳感器的阻抗響應(yīng)值隨著腺苷濃度的增加而增加，當腺苷濃度大于100 μmol/L時，電極的阻抗值反而減小。圖5B為傳感器對應(yīng)的阻抗值與腺苷濃度的響應(yīng)關(guān)系圖，當腺苷濃度在2.0~100 μmol/L范圍內(nèi)時，傳感器的阻抗值與腺苷的濃度呈線性關(guān)系 （見圖5B的內(nèi)插圖），其線性方程為I(Ω)=71.80 c(μmol/L)+ 5 453.8，線性相關(guān)系數(shù)為r=0.986 3，且最低檢測濃度為2.0 μmol/L，表明該方法對于腺苷樣品的定量檢測具有可行性。相對于較復雜的HPLC等儀器分析方法來說，該方法具有操作簡單、快速、實用性強的優(yōu)點，有望作為目標分子識別的一種通用傳感界面的設(shè)計，在分子生物學和生物醫(yī)學方面具有重要的應(yīng)用價值。

表2 基于級聯(lián)擴增核酸適體電化學傳感器檢測腺苷的重現(xiàn)性Tab.2 Reproducibility of the enzyme cascade amplification based electrochemical aptamer sensor for adenosine

圖5 級聯(lián)擴增核酸適體電化學傳感器檢測不同濃度腺苷的交流阻抗圖（A）和響應(yīng)關(guān)系圖（B）：圖中腺苷濃度a至f分別為0 μmol/L、2.0 μmol/L、10 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、1 000 μmol/LFig.5 Impedance spectra(A)and response relationship of the enzyme cascade amplification based electrochemical aptamer sensor for different concentrations of adenosine.The concentrations of adenosine from a to f are 0,2.0,10, 50,100,and 1 000 μmol/L

3 結(jié)論

該文聯(lián)用連接酶和滾環(huán)擴增酶，利用核酸適體的特異性結(jié)合能力，建立了一種腺苷檢測的新方法。在優(yōu)化的實驗條件下，腺苷濃度與阻抗信號值在2.0~100 μmol/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，最低檢測濃度為2.0 μmol/L。檢測體系對腺苷表現(xiàn)出很好的選擇性，腺苷同系物不干擾測定。該方法在設(shè)計上具有普遍應(yīng)用性，可適用于任一已知核酸適體的設(shè)計，可擴展到其他目標分子的檢測，因而具有更加廣闊的應(yīng)用前景。

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Enzyme cascade amplification based electrochemical aptamer sensing interface for adenosine detection

Wang Jun-xia,He Jing-lin*,Zeng Li-hong,Wu Ping,Zhu Shuang-li,Cao Zhong*
(Hunan Provincial Key Laboratory of Materials Protection for Electric Power and Transportation,School of Chemistry and Biological Engineering,Changsha University of Science and Technology,Changsha 410004,China)

A novel electrochemical aptamer sensing interface based on enzyme cascade amplification has been designed and constructed for detection of adenosine in this paper.In the presence of adenosine,the primer of the rolling circle amplification (RCA)was linked with the thiol-immobilized probe modified on gold electrode by E.coli DNA Ligase.The RCA was performed with pHi29 DNA polymerase to produce a long single strand,which was complementary to the circle template probe.Large amounts of gold nanoparticles labeled oligonucleotide probes were hybridized with the product of RCA.As a result,the impedance response of the sensing interface for recognition of adenosine was enhanced by the enzyme cascade amplification strategy.The proposed sensor possessed nice selectivity and reproducibility,and was applied to determination of adenosine samples with a linear range between 2.0 μmol/L and 100 μmol/L and a detection limit of 2.0 μmol/L.It can be seen that the strategy for design of the proposed sensing interface is expected to be used for any other targets detection as a general method.

sensing interface design;aptamer;enzyme cascade amplification;impedance;adenosine

國家自然科學基金(21105005,21275022,21075011)、湖南省教育廳科研基金(12B002)、教育部新世紀優(yōu)秀人才支持計劃(NCET-10-0138)項目資助

*聯(lián)系人,E-mail:jinglin_he2005@yahoo.com.cn(J.-L.He),zhongcao04@yahoo.com.cn(Z.Cao)