周玲艷，劉勝洪，秦華明，黎佩鳳，楊鳳婷，趙 鋼

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510225； 2.暨南大學(xué)理工學(xué)院，廣東 廣州 510623)

苜蓿(Medicagosativa)是世界上最主要的栽培面積最廣的優(yōu)良豆科牧草之一，以“牧草之王”著稱，在草田輪作、植被恢復(fù)和家畜養(yǎng)殖等方面發(fā)揮著重要作用[1]。但苜蓿生育期需水較多，每形成1 g干物質(zhì)需水700～800 g，田間需水量達(dá)5 855 m3·hm-2。而我國苜蓿主栽區(qū)干旱缺水，嚴(yán)重制約著苜蓿的大面積推廣，因此，對苜蓿的抗旱性研究顯得尤為重要。在過去幾十年里，對苜蓿的抗旱性研究取得了很多成果，研究內(nèi)容從抗旱性的鑒定方面逐步轉(zhuǎn)移到提高苜蓿自身抗旱性的研究上來。目前，苜蓿抗旱性育種方面的研究已經(jīng)成為該領(lǐng)域的主要研究方向。

植物表皮蠟質(zhì)是覆蓋于植物表皮角質(zhì)層上的一層可見的蠟狀隆起，在通過調(diào)控植物表皮滲透性、限制非氣孔性水分喪失以抵御水分脅迫方面發(fā)揮著重要作用[2-4]。張志飛等[5]發(fā)現(xiàn)高羊茅(Festucaelata)葉片表皮蠟質(zhì)可通過對氣孔導(dǎo)度的調(diào)節(jié)來減少氣孔蒸騰，提高水分利用效率，最終提高其抗旱性。張正斌和山侖[4]研究表明，蠟質(zhì)含量與蒸騰速率呈顯著正相關(guān)。Vogg等[6]在對番茄(Lycopersiconesculentum)蠟質(zhì)研究中發(fā)現(xiàn)，內(nèi)表皮蠟質(zhì)起著蒸騰屏障的作用。在擬南芥(Arabidopsisthaliana)[7-8]、水稻(Oryzasativa)[9]以及細(xì)莖冰草(Elymustrachycaulum)[10]中也均發(fā)現(xiàn)蠟質(zhì)含量與植物抗干旱能力呈正相關(guān)。也有研究者認(rèn)為，角質(zhì)層蠟質(zhì)組成[11-15]以及蠟質(zhì)結(jié)構(gòu)[16]是決定植物抗旱性的關(guān)鍵。Oliveira等[11]認(rèn)為，植物表皮水分滲透性與蠟質(zhì)成分的極性有關(guān)，低極性物質(zhì)能更有效的防止水分散失。但有關(guān)蠟質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)與葉水分散失過程之間的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

紫花苜蓿在逆境脅迫下可通過葉表皮蠟質(zhì)含量、成分或結(jié)構(gòu)的改變而提高抗逆性[10，17-19]，轉(zhuǎn)基因苜蓿蠟質(zhì)含量與抗干旱能力同樣呈正相關(guān)[20-21]。而不同品種之間蠟質(zhì)含量差異與抗旱性之間的關(guān)系尚未見報道。本研究以5個苜蓿品種為材料，分析苜蓿葉表面蠟質(zhì)覆蓋量以及抗性生理指標(biāo)，旨在探討不同苜蓿品種葉片蠟質(zhì)覆蓋量與抗旱性的關(guān)系，為選育抗旱苜蓿品種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1試驗材料 阿爾岡金、大富豪、WL525、苜蓿王和WL2321共5個苜蓿品種。材料種植地為廣州市仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院鐘村實驗場溫室大棚。苜蓿種子經(jīng)2% NaClO消毒后，在培養(yǎng)皿中發(fā)芽，挑取生長狀態(tài)一致的健康小苗種植于溫室大棚中，種植土壤質(zhì)地為壤土，定期澆水。自然光照，溫度為20～28 ℃，相對濕度為70%～90%。待苜蓿植株生長兩個月后，取不同苜蓿品種葉進(jìn)行各項指標(biāo)的測定。

1.2試驗方法

1.2.1不同苜蓿品種葉表面蠟質(zhì)掃描電鏡分析和含量測定 自植株上部采集第2片展開葉片，從葉中間沿葉脈切割，分正反兩面，距中間葉脈 0.1 cm 處剪取樣品進(jìn)行掃描電鏡觀察，葉片表面蠟質(zhì)掃描電鏡分析的材料處理和制作參照周玲艷等[22]的方法，每個苜蓿品種分別取3枚葉片進(jìn)行正反面表面蠟質(zhì)掃描電鏡觀察。葉片蠟質(zhì)提取參照周小云等[23]的方法，采用稱重法計算葉面積，每個苜蓿品種重復(fù)測定3次，取其平均值。

1.2.2不同苜蓿品種葉片葉綠素浸提率的測定 取1.5 g苜蓿葉片并剪碎至約3 cm長，浸泡在30 mL 80%的乙醇中，黑暗條件下輕輕搖晃，分別于20、40、50、60、90、120和210 min取3 mL浸提液用于測定其在λ664和λ647波長下的吸收值，每次測定后的浸提液倒回相應(yīng)的瓶中，每個品種各做3個重復(fù)。

葉綠素浸提量(mmol·g-1)=7.93A664+19.53A647；

葉綠素浸提率=(不同浸體時間的葉綠素浸提量/210 min時的葉綠素浸提量)×100%。

式中，不同浸體時間分別為20、40、50、60、90、120 min。

1.2.3脯氨酸含量測定 脯氨酸含量采用酸性水合茚酸酮法[24]測定。

1.2.4PEG模擬干旱處理 取不同苜蓿品種枝條插于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20% 的PEG-6000溶液中，25 ℃恒溫，光照強(qiáng)度為100～150 μmol·m-2·s-1，光照時間為14 h·d-1，觀察不同苜蓿品種生長狀態(tài)，并于處理36 h時進(jìn)行拍照，重復(fù)3次。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計 試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0及Excel 2003進(jìn)行分析處理。顯著水平為P<0.05(Dunman法)。

2 結(jié)果

2.1不同苜蓿品種葉片表面蠟質(zhì)晶體的掃描電鏡觀察 為了考察不同苜蓿品種葉表面蠟質(zhì)分布情況，本試驗采用掃描電鏡觀察苜蓿葉片。結(jié)果表明，苜蓿王和阿爾岡金葉片蠟質(zhì)片狀結(jié)構(gòu)大而密集；大富豪蠟質(zhì)片狀結(jié)構(gòu)也大，但較稀疏；WL2321和WL525葉片蠟質(zhì)片狀結(jié)構(gòu)小而稀疏(圖1)。

2.2不同苜蓿品種葉蠟質(zhì)含量測定 5個苜蓿品種中，苜蓿王的葉表面蠟質(zhì)含量最高，為0.539 mg·cm-2，大富豪、阿爾岡金和WL2321葉表面蠟質(zhì)含量相差不大，約為0.50 mg·cm-2，而WL525的葉表面蠟質(zhì)含量最低，只有0.402 mg·cm-2。苜蓿王與WL525葉表面蠟質(zhì)含量相差顯著(P<0.05)(表1)。

2.3不同苜蓿品種葉片的葉綠素浸提率測定 隨浸提時間的增加，各苜蓿品種的葉綠素浸提率增加(圖2)。在浸提初期，苜蓿王葉綠素浸提速率較快，但到60 min以后，其葉綠素浸提速率相對其他品種明顯減慢。在5個苜蓿品種中，WL525的葉綠素浸提率在不同時間段一直最大，且在90 min以內(nèi)，大富豪與WL525葉片的葉綠素浸提速率差異顯著(P<0.05)。

2.4不同苜蓿品種葉片的脯氨酸含量測定 脯氨酸是一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在植物抗旱性方面有著積極作用。不同苜蓿品種間的脯氨酸含量差異顯著(P<0.05)，苜蓿王的脯氨酸含量最高，為231.2 μg·g-1，其次是大富豪，為108.7 μg·g-1，再次為阿爾金剛和WL2321分別為72.9和60.9 μg·g-1，而WL525的脯氨酸含量最低，只有35.7 μg·g-1(表1)。

2.5不同苜蓿品種的PEG模擬干旱處理 對不同苜蓿品種的蠟質(zhì)覆蓋量和生理特性的分析表明，不同苜蓿品種之間存在著差異，而表面蠟質(zhì)在防止水分散失中起著非常重要的作用，可能與苜蓿植株的抗旱性有關(guān)。本研究取不同苜蓿品種枝條扦插于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20% 的PEG-6000溶液中進(jìn)行模擬干旱處理，結(jié)果表明，苜蓿王萎蔫程度最低(圖3)，說明苜蓿品種抗旱能力增強(qiáng)可能與植株葉片蠟質(zhì)覆蓋量增加有關(guān)。

3 討論與結(jié)論

植物表皮蠟質(zhì)層是植物自我防護(hù)的第一道屏障，對調(diào)控表皮滲透性、減少非氣孔性水分喪失等起著重要作用[3-4]。Weng等[12]發(fā)現(xiàn)擬南芥lacs1lacs2雙缺失突變體的葉綠素浸提率是野生型的4倍，失水率也比野生型高，對干旱更為敏感。Seo等[13]研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥MYB96轉(zhuǎn)錄因子突變體葉表面蠟質(zhì)含量與葉綠素浸提率和角質(zhì)蒸騰呈正相關(guān)。Leide等[14]的研究表明，番茄ps突變體果實表面失水率比對照快5～8倍。Vogg等[6]在對番茄蠟質(zhì)研究中發(fā)現(xiàn)，蠟質(zhì)組成，特別是內(nèi)表皮蠟質(zhì)起著蒸騰屏障的作用。郭彥軍等[19]在對苜蓿進(jìn)行水分脅迫處理試驗中發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)抗旱植株葉面蠟質(zhì)含量明顯高于弱抗旱植株，說明葉表皮蠟質(zhì)可能參與了控制水分散失的過程。本試驗掃描電鏡結(jié)果顯示，苜蓿葉表皮存在致密蠟質(zhì)層，蠟質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)呈片狀或梅花狀。掃描電鏡和蠟質(zhì)含量測定結(jié)果表明，不同品種苜蓿葉表面蠟質(zhì)含量不同，其中，苜蓿王的葉表面蠟質(zhì)分布較密集，蠟質(zhì)含量較高，而WL525葉表面蠟質(zhì)分布較稀疏，蠟質(zhì)含量較少。葉綠素浸提速率試驗表明，苜蓿王葉片在浸提后期葉綠素浸提速率相對其他品種明顯較慢，而WL525的葉綠素浸提率在不同時間段一直最大，說明不同苜蓿品種葉片表面蠟質(zhì)覆蓋與表皮滲透性呈正相關(guān)，可能參與調(diào)控水分的非氣孔性喪失。

圖1 不同苜蓿品種葉表面蠟質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)掃描電鏡觀察Fig.1 Scanning electron microscopy analysis on structure of leaf epicuticular wax crystals of different alfalfa varieties

表1 不同苜蓿品種葉表面蠟質(zhì)含量和脯氨酸含量測定Table 1 The total contents of leaf epicuticular wax and proline of different alfalfa varieties

張志飛等[5]認(rèn)為，表皮蠟質(zhì)含量可以作為高羊茅品種抗旱性鑒定的一個新指標(biāo)。表皮蠟質(zhì)含量對抗旱性的積極作用在其他多種植物的研究中已得到驗證，如Bourdenx等[8]在過表達(dá)擬南芥蠟質(zhì)合成相關(guān)基因CER1研究中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)CaMV35S::CER1擬南芥植株角質(zhì)層通透性比野生型和突變體的低，對干旱脅迫有更強(qiáng)的耐受力。Islam等[9]通過對蠟質(zhì)合成相關(guān)基因OsGL1-2的過表達(dá)發(fā)現(xiàn)，蠟質(zhì)的積累可增強(qiáng)水稻對干旱的抗性。Zhang等[20]將豆科植物的一個轉(zhuǎn)錄因子WXP1基因轉(zhuǎn)入苜蓿中，轉(zhuǎn)基因植株葉單位面積的蠟質(zhì)含量增加，抗旱性提高，而WXP1及WXP2轉(zhuǎn)化擬南芥同樣提高了其蠟質(zhì)含量和抗水分脅迫的能力[21]。本研究通過質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20% 的PEG-6000溶液進(jìn)行模擬干旱脅迫，結(jié)果表明，蠟質(zhì)含量最高的苜蓿王對干旱的敏感性最弱，說明苜?？赡芡ㄟ^蠟質(zhì)層的增厚而減少蒸騰來限制水分散失，增強(qiáng)植株抗旱能力。

圖2 不同苜蓿品種的葉綠素浸提率分析Fig.2 The Chlorophyll leaching assays of mature leaves from different alfalfa varietiess

圖3 不同苜蓿品種的PEG模擬干旱處理Fig.3 The simulated drought treatment of different alfalfa varieties

植物體內(nèi)脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性強(qiáng)的品種往往積累較多的脯氨酸[26]。逆境條件下，植物體內(nèi)脯氨酸含量顯著增加，脯氨酸積累量與抗旱性呈正相關(guān)[19,26-27]。本研究對5個苜蓿品種葉片脯氨酸含量測定表明，苜蓿王葉片脯氨酸含量最高，而WL525葉片脯氨酸含量最低。說明苜蓿也可能通過滲透調(diào)節(jié)來限制水分散失。

本試驗通過對苜蓿葉片表面蠟質(zhì)覆蓋觀察和蠟質(zhì)含量的測定以及抗旱生理和抗旱性分析，結(jié)果表明，苜蓿品種葉片表面蠟質(zhì)覆蓋與抗旱性存在一定的正相關(guān)性，可為抵抗各種生物和非生物脅迫的角質(zhì)層蠟質(zhì)基因在苜蓿品種的抗性改良和選育提供新途徑和參考指標(biāo)。

[1] 張桂國，楊在賓，董樹亭.苜蓿+玉米間作系統(tǒng)飼料生產(chǎn)潛力的評定[J].草業(yè)學(xué)報,2011,20(2):117-126.

[2] Riederer M,Schreiber L.Protecting against water loss:Analysis of the barrier properties of plant cuticles[J].Journal of Experimental Botany,2001,52:2023-2032.

[3] Sieber P,Schorderer M,Ryser U,etal.TransgenicArabidopsisplants expressing a fungal cutinase show alterations in the structure and properties of the cuticle and postgenital organ fusions[J].The Plant Cell,2000,12:721-738.

[4] 張正斌，山侖.小麥抗旱生理指標(biāo)與葉片卷曲度和蠟質(zhì)關(guān)系研究[J].作物學(xué)報,1998,24 (5):608-612.

[5] 張志飛，饒力群，向佐湘，等.高羊茅葉片表皮蠟質(zhì)含量與其抗旱性的關(guān)系[J].西北植物學(xué)報,2007,27(7):1417-1421.

[6] Vogg G,Fischer S,Leidw J,etal.Tomato fruit cuticular waxes and their effects on transpiration barrier properties:Functional characterization of a mutant deficient in a very-long-chain fatty acid beta-ketoacyl-CoA synthase[J].Journal of Experimental Botany,2004,55:1401-1410.

[7] Yang M,Yang Q Y,Fu T D,etal．Overexpression of theBrassicanapusBnLASgene inArabidopsisaffects plant development and increases drought tolerance[J].Plant Cell Reports,2011,30:373-388.

[8] Bourdenx B,Bernard A,Domergue F,etal.Overexpression ofArabidopsisECERIFERUM1 promotes wax very-long-chain alkane biosynthesis and influences plant response to biotic and abiotic stresses[J].Plant Physiology,2011,156:29-45.

[9] Islam M A,Du H,Ning J,etal.Characterization of Glossy1-homologous genes in rice involved in leaf wax accumulation and drought resistance[J].Plant Molecular Biology,2009,70:443-456.

[10] Jefferson P,Johnson D,Rumbaugh M,etal．Water stress and genotypic effects on epicuticular wax production of alfalfa and crested wheatgrass in relation to yield and excised leaf water loss rate[J].Canadian Journal of Plant Science,1989,69:481-490.

[11] Oliveira A F M,Meirelles S T,Salatino A.Epicuticular waxes from caatinga and cerrado species and their efficiency against water loss[J].Anais da Academia Brasileira de Ciencias,2003,75:431-439.

[12] Weng H,Molina I,Shockey J,etal.Organ fusion and defective cuticle function in a lacs1 lacs2 double mutant ofArabidopsis[J].Planta,2010,231:1089-1100.

[13] Seo P J,Lee S B,Suh M C,etal.The MYB96 transcription factor regulates cuticular wax biosynthesis under drought conditions inArabidopsis[J].The Plant Cell,2011,23:1138-1152.

[14] Leide J,Hildebrandt U,Vogg G,etal.The positional sterile (ps)mutation affects cuticular transpiration and wax biosynthesis of tomato fruits[J].Journal of Plant Physiology,2011,168 9:871-877.

[15] Xia Y,Yu K,Navarre D,etal.The glabra1 mutation affects cuticle formation and plant responses to microbes[J].Plant Physiology,2010,154:833-846.

[16] Park J J,Jin P,Yoon J,etal.Mutation in Wilted Dwarf and Lethal 1 (WDL1)causes abnormal cuticle formation and rapid water loss in rice[J].Plant Molecular Biology,2010,74:91-103.

[17] 郭彥軍，倪郁，郭蕓江，等.空氣濕度與土壤水分脅迫對紫花苜蓿葉表皮蠟質(zhì)特性的影響[J].生態(tài)學(xué)報,2011,31(18):5273-5280.

[18] 郭彥軍，郭蕓江，唐華，等.紫外線輻射與土壤干旱脅迫對紫花苜蓿葉表皮蠟質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)及含量的影響[J].草業(yè)學(xué)報,2011,20(6):77-84.

[19] 郭彥軍，倪郁，郭蕓江，等.水熱脅迫對紫花苜蓿葉表皮蠟質(zhì)組分及生理指標(biāo)的影響[J].作物學(xué)報,2011,37(5):911-917.

[20] Zhang J Y,Broeckling C D,Blancaflor E B,etal.Over-expression ofWXP1,a putativeMedicagotruncatulaAP2 domain-containing transcription factor gene,increases cuticular wax accumulation and enhances drought tolerance in transgenic alfalfa (Medicagosativa)[J].The Plant Journal:for Cell and Molecular Biology,2005,42:689-707.

[21] Zhang J Y,Broeckling C D,Sumner L W,etal.Heterologous expression of twoMedicagotruncatulaputative ERF transcription factor genes,WXP1 andWXP2,in Arabidopsis led to increased leaf wax accumulation and improved drought tolerance,but differential response in freezing tolerance[J].Plant Molecular Biology,2007,64:265-278.

[22] 周玲艷，姜大剛，莊楚雄，等.逆境處理下水稻葉角質(zhì)層蠟質(zhì)積累及其與蠟質(zhì)合成相關(guān)基因OsGL1表達(dá)的關(guān)系[J].作物學(xué)報,2012,38(6):1115-1120.

[23] 周小云，陳信波，徐向麗，等.稻葉表皮蠟質(zhì)提取方法及含量的比較[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2007,33:273-276.

[24] 李合生.植物生理生化實驗原理和技術(shù)[M].北京:高等教育出版社,2006:250-256.

[25] 李紅,李波,王麗玲，等.紫花苜蓿耐羥脯氨酸變異體的篩選及抗性研究[J].草業(yè)科學(xué),2011,28(9):1700-1705.

[26] 趙瑞雪，朱慧森，程鈺宏，等.植物脯氨酸及其合成酶系研究進(jìn)展[J].草業(yè)科學(xué),2008,25(2):90-95.

[27] 桑子陽，馬履一，陳發(fā)菊.干旱脅迫對紅花玉蘭幼苗生長和生理特性的影響[J].西北植物學(xué)報,2011,31(1):109-115.