岳 樺，李 雪

(東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

大慶地處松嫩平原中部，地形平坦，土壤含鹽量高，春季風(fēng)大，干旱少雨，冬季寒冷干燥[1],由于常年干旱，加之土壤結(jié)構(gòu)特性，大慶草原屬于干旱生境，自然環(huán)境較差，能適應(yīng)此生境的植物資源相對(duì)貧乏，因而，引種適宜生境的植物資源十分必要。

柳葉水甘草(Amsoniatabernaemontana)為夾竹桃科水甘草屬多年生草本植物。水甘草屬全世界約有30種，多分布于日本和中國的長江流域[2]，民間用作清熱解毒藥，治療惡瘡炎癥等[3]。柳葉水甘草引自日本，植株高1 m，莖草綠色，花期較短，觀葉、觀果，是多年生、低維護(hù)性花卉。現(xiàn)已種植應(yīng)用在沈陽及哈爾濱等地，是一種良好的觀賞植物。目前，國內(nèi)外對(duì)柳葉水甘草的研究多集中在化學(xué)成分提取及藥理作用方面[3]，而生理方面的研究較少，關(guān)于干旱脅迫下的種子萌發(fā)和幼苗的抗旱性及生理響應(yīng)研究仍處于空白階段。種子萌發(fā)是植物生活史中的關(guān)鍵階段，這一階段發(fā)育的好壞，不僅影響種子本身的播種品質(zhì)，而且還可能影響到種子下一代的生長發(fā)育[4]，因此，種子萌發(fā)期及幼苗期是進(jìn)行抗旱性研究的重要時(shí)期。本研究以聚乙二醇(PEG-6000)模擬干旱脅迫的方法，分析比較不同干旱脅迫對(duì)柳葉水甘草種子萌發(fā)及幼苗的影響，評(píng)價(jià)其對(duì)干旱脅迫的適應(yīng)能力與抗旱機(jī)理，從而為柳葉水甘草的引種馴化和園林應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1供試材料 供試材料柳葉水甘草種子采收于東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院苗圃，采收后將種子置于常溫下自然晾干，4 ℃冰箱中保存。2012年5月在東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2PEG干旱脅迫質(zhì)量分?jǐn)?shù) 采用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PEG溶液，形成不同的干旱條件。用分子量為6 000的PEG配制成不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的滲透溶液，設(shè)置5組質(zhì)量分?jǐn)?shù)，分別為5%、10%、15%、20%和25%，對(duì)應(yīng)溶液水勢(shì)梯度為-0.054、-0.177、-0.393、-0.735和-0.900 MPa[5]，蒸餾水作對(duì)照，每處理3次重復(fù)。

1.3種子萌發(fā)及幼苗PEG干旱脅迫處理方法 試驗(yàn)挑選優(yōu)質(zhì)、飽滿種子，2%的次氯酸鈉溶液處理大約10 min，蒸餾水沖洗干凈。鋪3層濾紙于90 mm的玻璃培養(yǎng)皿中，加入對(duì)應(yīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PEG溶液吸濕濾紙，每皿放入30粒種子，置于30 ℃恒溫、16 h光照的培養(yǎng)箱中。光強(qiáng)設(shè)置為5 000 lx，濕度66%。每兩天更換一次濾紙。從種子置床之日起觀察，以胚根露出種皮1～2 mm作為為萌發(fā)標(biāo)志。 將試驗(yàn)各處理中最早有1 粒種子萌發(fā)之日作為該處理發(fā)芽的開始日期，每天定時(shí)記錄萌發(fā)種子數(shù)，萌發(fā)末期連續(xù)3 d萌發(fā)粒數(shù)不足供試種子總數(shù)的1%時(shí)，記為萌發(fā)結(jié)束[6]。處理結(jié)束后，用蒸餾水洗凈未萌發(fā)種子，進(jìn)行恢復(fù)試驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證柳葉水甘草種子對(duì)干旱脅迫的恢復(fù)能力。

選擇長勢(shì)均勻一致的幼苗(苗高約5 cm)，移栽到錐形瓶中，添加50 mL的蒸餾水，并加適量的營養(yǎng)液，置于光照恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)(30 ℃、全光)，育苗3 d后，分別將溶液置換為5%、10%、15%、20%、25%的PEG溶液，等量的蒸餾水作為對(duì)照，每6 h測(cè)定一次指標(biāo)，連續(xù)測(cè)定5次，24 h后全部復(fù)水，進(jìn)行恢復(fù)試驗(yàn)。

1.4相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

1.4.1種子萌發(fā)相關(guān)參數(shù)

1)萌發(fā)率(GR)=萌發(fā)種子數(shù)/供試種子總數(shù)×100%。

2)萌發(fā)速率系數(shù)(CGR)=[∑(t×n) /∑n]×100。

式中，t為自萌發(fā)試驗(yàn)開始時(shí)的天數(shù)；n為在t天內(nèi)萌發(fā)的種子數(shù)[7]。

3)萌發(fā)指數(shù)(GI)=∑Gt/Dt。

4)活力指數(shù)(VI)=GI×S。

式中，Gt為第t天的發(fā)芽數(shù)，Dt為發(fā)芽天數(shù)，S為苗長。

1.4.2幼苗相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定 葉片電解質(zhì)滲透率采用電導(dǎo)儀法測(cè)定[8]；葉片脯氨酸(Pro)含量采用磺基水楊酸提取，茚三酮顯色法測(cè)定[9]；采用氮藍(lán)四唑(NBT)還原法、愈創(chuàng)木酚法、硫代巴比妥酸(TBA)雙組分光光度法測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、過氧化物酶(POD)[10]，在酶活性的測(cè)量中使用的主要儀器為UV-4802型雙束紫外分光光度計(jì)和Z323K型高速冷凍離心機(jī)，每組5次平行。

1.5數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)應(yīng)用SPSS 17.0軟件，數(shù)據(jù)差異比較采用單因素方差分析和最小顯著差異法，相關(guān)性評(píng)價(jià)采用Pearson相關(guān)系數(shù)法。Excel 2000作表。

2 結(jié)果與分析

2.1PEG干旱脅迫對(duì)柳葉水甘草種子萌發(fā)的影響 柳葉水甘草種子的萌發(fā)率為96.67%，隨著PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，種子萌發(fā)率、萌發(fā)速率系數(shù)、萌發(fā)指數(shù)和活力指數(shù)均呈現(xiàn)小幅度上升再下降的趨勢(shì)(表1)。

PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到20%(-0.735 MPa)時(shí)，萌發(fā)率為0。不僅各處理組與對(duì)照組的差異均達(dá)到顯著水平(P<0.05)，而且各處理組之間的差異均達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。其中在低質(zhì)量分?jǐn)?shù)(5%)處理時(shí)，種子萌發(fā)率較對(duì)照組顯著增高，說明PEG溶液對(duì)種子萌發(fā)起到了促進(jìn)作用。15%PEG脅迫下種子萌發(fā)率僅19.43%，受到極顯著的抑制作用。20%和25%PEG完全抑制了種子的萌發(fā)，同時(shí)各處理組均出現(xiàn)了程度不同、數(shù)量不等的種子腐爛現(xiàn)象，而對(duì)照組種子無腐爛現(xiàn)象發(fā)生或極輕微可忽略不計(jì)。以上結(jié)果說明，柳葉水甘草種子萌發(fā)階段具有一定的耐干旱脅迫的能力。

PEG脅迫結(jié)束后，復(fù)水處理20%和25%PEG抑制不萌發(fā)的種子，發(fā)現(xiàn)恢復(fù)能力較強(qiáng)，仍能萌發(fā)(表2)。復(fù)水處理后20%和25%PEG脅迫種子萌發(fā)率高達(dá)91.57%和85.78%，萌發(fā)速率系數(shù)較大，5 d內(nèi)萌發(fā)率已超過85%。而一些出現(xiàn)腐爛現(xiàn)象的種子萌發(fā)并沒有受到影響，這可能與種子自身結(jié)構(gòu)相關(guān)，具有種殼的種子內(nèi)部并未受到影響。因此，柳葉水甘草種子在萌發(fā)前進(jìn)行低質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PEG脅迫處理，有利于提高其種子萌發(fā)率和萌發(fā)速率系數(shù)等各項(xiàng)指標(biāo)，體現(xiàn)了柳葉水甘草種子的抗旱能力及抗旱品質(zhì)。

表1 不同PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)柳葉水甘草種子萌發(fā)的影響Table 1 Effects of different concentrations of PEG on the seed germination of Amsonia tabernaemontana

表2 不同PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)處理后復(fù)水對(duì)不萌發(fā)柳葉水甘草種子萌發(fā)的影響Table 2 Effects of water recovery on the nongerminated seeds of Amsonia tabernaemontana after different concentrations of PEG treatments

2.2PEG干旱脅迫對(duì)幼苗葉片相對(duì)電導(dǎo)率和丙二醛含量的影響 在輕度脅迫(5%)初期(6 h)，與對(duì)照組相比，葉片的MDA含量反而下降了(表3)，相對(duì)電導(dǎo)率在干旱下一直略有增加(表4)，而重度脅迫(≥15%)及脅迫末期，葉片MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率急劇升高，明顯大于對(duì)照組，說明在輕度脅迫及干旱脅迫初期，柳葉水甘草葉片能夠主動(dòng)進(jìn)行生理調(diào)節(jié)，降低膜脂過氧化程度，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，其抗旱能力增強(qiáng)。重度脅迫及脅迫末期，植物體內(nèi)代謝開始紊亂，出現(xiàn)膜脂過氧化的現(xiàn)象，離子大量外滲導(dǎo)致MDA含量不斷積累，抗旱能力下降。嚴(yán)重脅迫(20%、25%)下，復(fù)水都無法恢復(fù)到正常生命狀態(tài)，說明質(zhì)膜損害已經(jīng)難以恢復(fù)，基本喪失抗旱能力。

2.3PEG干旱脅迫對(duì)幼苗葉片脯氨酸含量的影響 通過測(cè)量柳葉水甘草葉片游離脯氨酸的含量變化(表5)來研究葉片的滲透調(diào)節(jié)能力。在5個(gè)處理組模擬干旱環(huán)境下，脯氨酸含量表現(xiàn)出隨時(shí)間的延長和程度的加深而逐漸升高的變化趨勢(shì)，處理24 h后的5%、10%、15%、20%和25%處理下脯氨酸的含量分別為對(duì)照組含量的3.47、3.72、4.45、4.56和4.59倍。24 h后復(fù)水表明，輕度脅迫(5%、10%)下，脯氨酸含量逐漸降低；中度脅迫下(15%、20%)，含量雖有降低，但仍與對(duì)照組差異顯著；重度脅迫(25%)下，脯氨酸含量持續(xù)下降，說明已經(jīng)喪失了葉片滲透調(diào)節(jié)能力，25%PEG處理24 h已使幼苗處于致死狀態(tài)。

表3 不同PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)柳葉水甘草幼苗葉片的丙二醛含量的影響Table 3 Effects of different concentrations of PEG on MDA content of seedling leaves of Amsonia tabernaemontana %

表4 不同PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)柳葉水甘草幼苗葉片的相對(duì)電導(dǎo)率含量的影響Table 4 Effects of different concentrations of PEG on relative electric conductivity of seedling leaves of Amsonia tabernaemontana %

表5 不同PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)干旱脅迫下柳葉水甘草幼苗葉片的脯氨酸含量Table 5 Proline contents in seedling leaves of Amsonia tabernaemontana under different concentrations of PEG treatments μg·g-1FM

2.4PEG干旱脅迫對(duì)幼苗葉片抗氧化酶系統(tǒng)的影響 SOD和POD為植物體內(nèi)兩種重要的抗氧化保護(hù)酶。隨著脅迫程度的加深和脅迫時(shí)間的增加，柳葉水甘草葉片的兩種酶活性呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)(表6、表7)，說明低質(zhì)量分?jǐn)?shù)和短時(shí)間的干旱脅迫可促進(jìn)柳葉水甘草葉片的抗氧化酶SOD和POD的活性；但高質(zhì)量分?jǐn)?shù)和長時(shí)間的PEG脅迫抑制抗氧化酶的活性，使得活性降低。

SOD活性在5%、10%脅迫下最大，12 h處理后分別為對(duì)照組的1.40和1.28倍，即輕度脅迫可激發(fā)SOD的活性；POD則在15%處理12 h時(shí)達(dá)到最大值，活性最強(qiáng)；在20%、25%脅迫條件下SOD和POD活性均下降。復(fù)水后各脅迫條件下，均有不同程度恢復(fù)。

2.5PEG干旱脅迫下幼苗葉片各生理生化指標(biāo)的相關(guān)分析 干旱脅迫下柳葉水甘草葉片各生理生化指標(biāo)的相關(guān)性見表8，相對(duì)電導(dǎo)率與丙MDA含量和脯氨酸含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與SOD活性呈極顯著負(fù)相關(guān)；丙二醛與脯氨酸含量呈極顯著正相關(guān)，與SOD和POD活性呈極顯著負(fù)相關(guān)；SOD活性與POD活性呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。

表6 不同PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)干旱脅迫下柳葉水甘草幼苗葉片的SOD活性Table 6 Activities of SOD in seedling leaves of Amsonia tabernaemontana under different concentrations of PEG treatments

表7 不同PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)干旱脅迫下柳葉水甘草幼苗葉片的POD活性Table 7 Activities of POD in seedling leaves of Amsonia tabernaemontana under different concentrations of PEG treatments

表8 不同PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)干旱脅迫下柳葉水甘草幼苗葉片各生理生化指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)Table 8 Correlation coefficients of physiological and biochemical indexes in seedling leaves of Amsonia tabernaemontanaunder different concentrations of PEG treatments

3 討論與結(jié)論

輕度脅迫(5%)時(shí)，種子萌發(fā)率提高，葉片相對(duì)電導(dǎo)率、MDA含量、脯氨酸含量、SOD和POD活性均有所提高，柳葉水甘草抗旱水平上升；中度脅迫(10%、15%)時(shí)，種子萌發(fā)率下降，葉片相對(duì)電導(dǎo)率、MDA含量、脯氨酸含量、SOD和POD活性出現(xiàn)浮動(dòng)，但基本保持上升趨勢(shì)，柳葉水甘草仍表現(xiàn)出一定的抗旱能力；重度脅迫(20%、25%)時(shí)，種子不萌發(fā)，葉片相對(duì)電導(dǎo)率、MDA含量、脯氨酸含量繼續(xù)增加，SOD和POD活性均有所下降，基本喪失抗旱性。

PEG是一種滲透調(diào)節(jié)劑，在調(diào)節(jié)礦質(zhì)元素、激素變化、蛋白質(zhì)代謝和影響信號(hào)傳導(dǎo)方面起著重要的作用[11]，其主要功能是減緩萌發(fā)初期水分進(jìn)出種子的速率，可降低種子吸漲過程中膜系統(tǒng)的損傷且有利于受損膜系統(tǒng)的修復(fù)[12]。5% PEG脅迫可以提高柳葉水甘草種子的萌發(fā)率及活力指數(shù)等，超過這個(gè)閾值，各指標(biāo)呈逐漸下降趨勢(shì)。說明此質(zhì)量分?jǐn)?shù)的脅迫處于柳葉水甘草種子的耐受范圍內(nèi)，能夠啟動(dòng)種子體內(nèi)自身的一系列保護(hù)機(jī)制，減少吸脹過程中膜系統(tǒng)的損傷，有利于膜系統(tǒng)的修復(fù)，從而提高種子抗旱能力；當(dāng)PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大時(shí)，超過了其耐受范圍，種子萌發(fā)受到抑制?；謴?fù)試驗(yàn)進(jìn)行復(fù)水后，仍具有較高的萌發(fā)率，可見膜系統(tǒng)并未受到損傷，只是暫時(shí)性抑制，種子仍具有萌發(fā)的能力。這個(gè)結(jié)論與焦樹英等[13]的研究結(jié)果相一致。植物體內(nèi)的游離脯氨酸含量在一定程度上反映了植株體內(nèi)的水分狀況，因而可以作為植物缺水情況的參考性生理指標(biāo)[14],但是脯氨酸與植物的抗旱性之間的關(guān)系仍存在爭議。有研究[15-16]認(rèn)為，干旱脅迫下脯氨酸積累量與抗旱性呈正相關(guān)；也有研究[17]認(rèn)為，脯氨酸的積累屬于干旱脅迫產(chǎn)生的結(jié)果，因?yàn)橛行┲参镌谀婢硹l件下脯氨酸含量變化不大。本研究中，干旱脅迫下的幼苗葉片中脯氨酸含量顯著增加，也與相對(duì)電導(dǎo)率及MDA含量呈極顯著正相關(guān)，在脅迫后期顯著增加，說明脯氨酸積累對(duì)干旱脅迫有相關(guān)反應(yīng)，本研究認(rèn)為，將葉片中的游離脯氨酸含量變化看作干旱脅迫下的生理響應(yīng)比較合理，此結(jié)論與盧少云等[17]研究結(jié)果一致。在植物遭遇到環(huán)境脅迫時(shí)，植物體內(nèi)的保護(hù)酶系統(tǒng)開始發(fā)揮作用以此進(jìn)行自我防御。在脅迫試驗(yàn)中，酶活性一般隨脅迫加深而增加，或者呈先增加后降低的基本態(tài)勢(shì)[18]。本研究表明，柳葉水甘草SOD和POD活性先升后降，在低質(zhì)量分?jǐn)?shù)和短時(shí)間的PEG脅迫范圍內(nèi)，植株體內(nèi)通過自身增加酶的活性來調(diào)節(jié)平衡，使其適應(yīng)干旱脅迫能力增強(qiáng)。如果干旱脅迫超過一定的耐受范圍，其保護(hù)酶的活性會(huì)逐漸減弱，柳葉水甘草的耐干旱能力隨之減弱，表明柳葉水甘草對(duì)干旱脅迫的忍耐有一定局限性。SOD在脅迫初期，表現(xiàn)最活躍，啟動(dòng)了自身防御系統(tǒng)，在一定程度上調(diào)節(jié)了自身的平衡；隨著脅迫程度的加深，植物體內(nèi)的代謝開始出現(xiàn)紊亂，SOD活性也大幅下降。POD活性的高峰則出現(xiàn)在SOD開始下降時(shí)期，原因可能是因?yàn)镾OD產(chǎn)生的大量H2O2，作為清除H2O2的活性酶過氧化物酶開始大量產(chǎn)生并且表達(dá)，說明這兩種酶表現(xiàn)為相互協(xié)調(diào)的作用，呈現(xiàn)顯著正相關(guān)性。

從幼苗生理生化指標(biāo)相關(guān)性分析中可以看出，PEG模擬干旱脅迫下柳葉水甘草相對(duì)電導(dǎo)率與SOD活性呈極顯著負(fù)相關(guān)；MDA含量與SOD和POD活性呈極顯著負(fù)相關(guān)，說明在干旱脅迫下，幼苗自身生理調(diào)節(jié)功能失衡，出現(xiàn)膜脂過氧化的現(xiàn)象，離子大量外滲導(dǎo)致MDA含量不斷積累，又反作用于抗氧化酶，抑制酶活性，減弱酶系統(tǒng)的基本功能。如此多重作用于植株，最終干旱脅迫致死。

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