趙海福，魏彥明，董曉寧，王廷璞，趙 強(qiáng)，劉文博

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070； 2.天水師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，甘肅 天水 741001；3.新疆大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046)

玉米(Zeamays)須為玉米的花柱和柱頭[1]。玉米在我國種植廣泛，玉米須為玉米的主要副產(chǎn)品之一，富含揮發(fā)油、皂苷、黃酮類、多糖、尿囊素和有機(jī)酸等多種對人體有益的化學(xué)成分，具有利尿、降血糖、降壓、抑菌、增強(qiáng)免疫以及抗癌等功效[2-4]。玉米須中富含的黃酮類物質(zhì)有抗氧化、抗病毒等作用，可有效清除機(jī)體內(nèi)的超氧陰離子和羥基自由基[5-8]。

蘆丁作為黃酮類中最為常見的一種化合物，具有與黃酮類化合物相近的性質(zhì)和功能。玉米須作為天然原材料，從其中提取藥物更安全，因此，研究從玉米須中提取蘆丁有實(shí)用性、經(jīng)濟(jì)性和時(shí)代需求性。目前，國內(nèi)外均以研究玉米須中的黃酮為主，少有以蘆丁為研究對象的報(bào)道，因此，本研究選取蘆丁進(jìn)行研究。索氏回流法具有能用少量溶劑連續(xù)循環(huán)提取的特點(diǎn)，乙醇是最常用的廉價(jià)安全溶劑而超聲波具有粉碎細(xì)胞的能力。賈雪峰[9]在提取苦蕎麥(Fagopyrumtataricum)中的蘆丁時(shí)選用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇作為提取劑，效果明顯。因此，本試驗(yàn)選用乙醇為溶劑，采用超聲振蕩處理輔助索氏回流法提取玉米須中的蘆丁。

本試驗(yàn)在單因素水平篩選的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken響應(yīng)面法中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)[10-12]，對玉米須中蘆丁的提取工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，并用紫外、紅外光譜和高效液相色譜(HPLC)對提取物成份及純度進(jìn)行檢測，以期為玉米須的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1植物材料 新鮮玉米須，采自甘肅省臨洮縣衙下鎮(zhèn)，經(jīng)自然風(fēng)干、粉碎后過0.180 mm篩。

1.1.2試劑 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn))，乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、甲醇、3%硼砂、石灰水、鹽酸、磷酸等均為分析純試劑。

1.1.3儀器 Agilent 1100型高效液相色譜儀(安捷倫)、UV751-GD紫外-可見分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)、RE52-99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)、紫外可見光光度計(jì)(Lambda 35型，Perkin Elmer Precisely)、數(shù)控超聲波清洗器(KQ-500DE型，昆山市超聲儀器有限公司)、FA22048電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)、傅立葉變換紅外光譜儀(Spectrum one B型，Perkin Elmer Precisely產(chǎn)品)、 SHB-Ⅳ雙A 循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)、瑪瑙研缽、石英比色皿。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取0.200 8 g蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，溶解后移入100 mL容量瓶中，定容、搖勻，稀釋至體積為原來的1.5倍，得到質(zhì)量濃度為1.34g·L-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別移取1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00和8.00 mL置于50 mL容量瓶中，并分別加入5.0 mL 5%的NaNO2溶液，6 min后加入10.0 mL 1%的Al(NO3)3溶液，再6 min后加入20.0 mL 4%的NaOH溶液，15 min后定容、搖勻，得到質(zhì)量濃度分別為0.026 8、0.053 6、0.080 8、0.107 2、0.134 0、0.160 8、0.187 6和0.214 4 mg·mL-1的蘆丁梯度溶液，以雙重蒸餾水為參比，在510 nm處測定其吸光度值，繪制濃度-吸光度值標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2玉米須蘆丁樣液的制備 準(zhǔn)確稱取干燥的玉米須粉末8.0 g，按設(shè)計(jì)時(shí)間浸泡，在不同的溫度與功率下超聲振蕩處理。采用索氏回流法提取玉米須中的蘆丁。將提取液轉(zhuǎn)入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，減壓濃縮至無醇味后轉(zhuǎn)入100 mL錐形瓶，加入少許活性炭脫色，靜置過夜，抽濾，將濾液按編號(hào)裝入容量瓶，并定容至50 mL，靜置待測定。

1.2.3蘆丁含量的測定 將樣液用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法處理后，在510 nm處測定吸光度值，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算玉米須中蘆丁的含量[13-15]。

式中，C為提取物中蘆丁含量(mg·mL-1)，V為體積(mL)，B為稀釋倍數(shù)，m為玉米須的質(zhì)量(g)。

1.2.4玉米須中蘆丁的提取工藝 選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、超聲時(shí)間、索氏回流時(shí)間、浸泡時(shí)間、超聲溫度、超聲功率和浸提液pH值8個(gè)因素依次進(jìn)行單因素提取試驗(yàn)[15]。各因素的水平梯度設(shè)置的乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為35%、40%、45%、50%、55%、60%和65%；液料比(mL·g-1)為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1和40∶1；超聲時(shí)間為20、25、30、35、40、45和50 min；回流時(shí)間為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0和3.5 h；浸泡時(shí)間為0、6、12、18、24、30和36 h；超聲溫度為30、35、40、45、50、55和60 ℃；超聲功率為200、250、300、350、400、450和500 W；浸提液pH值為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0。采用極差分析法篩選出4個(gè)主要因素，然后按照響應(yīng)面法進(jìn)行蘆丁提取，最后建立玉米須中蘆丁的提取工藝。

在此工藝下同法制備蘆丁樣液，用9%的鹽酸調(diào)節(jié)樣液pH值至3～4，靜置過夜，自然冷卻析晶后得蘆丁粗品。將蘆丁粗品用150 mL蒸餾水溶解于250 mL燒杯中，加熱，攪拌，再加入3%的硼砂溶液5 mL，用飽和石灰水調(diào)節(jié)pH值為8～9，煮沸至粗品溶解后，趁熱減壓抽濾，將濾液用9%的鹽酸調(diào)節(jié)pH值為3～4，靜置過夜，析出晶體，得蘆丁樣品。

1.2.5玉米須蘆丁樣品的分析

1)紫外光譜分析：用甲醇做空白對照，選擇波長范圍為190～450 nm，采用Lambda 35型紫外可見光光度計(jì)，對蘆丁樣品進(jìn)行測定分析[16]。

2)紅外光譜分析：準(zhǔn)確稱取2 mg蘆丁樣品和300 mg KBr錠劑，在瑪瑙研缽中混合均勻并研磨。取200 mg已研磨的混合物，用錠劑成型器制成薄片，選取吸收頻率范圍為450～4 000 cm-1，采用Spectrum One傅立葉紅外光譜儀，對蘆丁樣品進(jìn)行檢測[16]。

3)高效液相色譜法分析

①色譜條件為色譜柱：Zorbax eclipse XDB C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.2%磷酸溶液(65∶35)；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：254 nm；溫度：30±1 ℃；進(jìn)樣量：20 μL[17]。

②HPLC測定的工作曲線的繪制：準(zhǔn)確配制質(zhì)量濃度為0.025 mg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，靜置備用。將其依次配成質(zhì)量濃度為0.188、0.375、0.750、1.500和3.000 μg·mL-1的蘆丁梯度溶液，進(jìn)行HPLC檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線 根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品系列質(zhì)量濃度梯度在510 nm處測定的吸光值，得回歸方程：Y=3.935 5X+0.006 3(R2=0.991 3，n=8)，在0.02～0.25 mg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性相關(guān)關(guān)系。

2.2單因素試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果(表1)，以蘆丁含量為指標(biāo)，選出每個(gè)因素的最優(yōu)水平，即對應(yīng)的蘆丁含量最高。

2.3響應(yīng)面法優(yōu)化的工藝條件

2.3.1響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平的選擇 對單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析，最終選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、回流時(shí)間和超聲時(shí)間4個(gè)因素為自變量，玉米須蘆丁含量為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面分析法設(shè)計(jì)，進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)(表2)，以優(yōu)化玉米須蘆丁的提取工藝[15]。每組試驗(yàn)3次重復(fù)。

表1 單因素試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of the single factor experiment

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平Table 2 Factor level of response surface

2.3.2中心組合試驗(yàn)結(jié)果 采用Design-Expert 7.0分析軟件，以玉米須蘆丁含量為指標(biāo)，利用Box-Behnken中心設(shè)計(jì)原理[10-12]，以蘆丁的含量為響應(yīng)值，影響其含量的4個(gè)主要因素A(乙醇體積分?jǐn)?shù))、B(液料比)、C(回流時(shí)間)和D(超聲時(shí)間)為自變量，進(jìn)行4因素3水平的Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)(表3)。

表3中1～24是析因試驗(yàn)，25～29是中心試驗(yàn)，29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)分別為析因點(diǎn)和零點(diǎn)，其中析因點(diǎn)為A、B、C和D所構(gòu)成的三維空間的頂點(diǎn)，零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)，中心試驗(yàn)3次重復(fù)。

2.3.3不同因素對玉米須蘆丁含量的影響 采用RSA程序?qū)λ脭?shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到4個(gè)因子與玉米須蘆丁含量的回歸方程：

Y=12.956 8+0.268 3A+0.658 8B-0.878 4C+0.356 1D-0.982 8AB-0.114 3AC+0.788 8AD+0.079 5BC-0.448 5BD-0.546 0CD-1.817 4A2-2.2902B2-1.586 9C2-1.746 4D2.

并對回歸模型進(jìn)行方差分析(表4)。

分析結(jié)果表明，影響因素與回歸方程的關(guān)系達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，失擬項(xiàng)也達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，說明該回歸方程與實(shí)際情況相符(R2=0.858 2)，因此可以用該方程對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。各因素之間的影響存在一定互作，而不是簡單的線性關(guān)系，其中A2、B2、C2、D2極顯著(P<0.01)，C顯著(P<0.05)，其余互作均不顯著(P>0.05)(表4)。

表3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Table 3 RSD and results

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析Table 4 Variance analysis of response surface

一次項(xiàng)(P=0.353 5)為不顯著項(xiàng)，表明各因素與響應(yīng)值不只是簡單的線性關(guān)系。從單因素水平來看，各因素對玉米須蘆丁提取率的影響依次為：回流時(shí)間>液料比>超聲時(shí)間>乙醇體積分?jǐn)?shù)。而二次項(xiàng)(P=0.000 3)為高度顯著項(xiàng)，在有互作的情況下，各因素與響應(yīng)值的關(guān)系是卷曲的；對玉米須蘆丁提取率的影響順序?yàn)锳B>AD>CD>BD>AC>BC(表4)。

2.3.4響應(yīng)面最佳工藝條件的確定 根據(jù)響應(yīng)方程繪制的響應(yīng)面曲線圖和等高線圖，響應(yīng)面圖形能直觀地反映各因素和它們之間的互作對響應(yīng)值的影響。響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值Y與試驗(yàn)因素A、B、C和D相對應(yīng)構(gòu)成的三維曲線圖，具體做法是將兩個(gè)因素固定在零水平，然后再做剩下的兩個(gè)因素交互作用的響應(yīng)面曲線圖(圖1)。

從各因素之間的等高線圖和響應(yīng)面圖可知，其曲線走勢的坡度越陡，影響越顯著；坡度越平滑，影響越小。由Design-Expert 7.0軟件的系統(tǒng)分析結(jié)果得出，影響玉米須蘆丁含量的最佳提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)49.09%、液料比30.72 mL∶1 g、回流時(shí)間1.73 h以及超聲時(shí)間35.86 min，在該條件下蘆丁的得率為12.71 mg·g-1。結(jié)合實(shí)際操作過程，考慮相關(guān)的局限性，對此最佳工藝進(jìn)行修正，修正后的工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)49%、液料比30 mL∶1 g、回流時(shí)間1.7 h以及超聲時(shí)間36 min，在該工藝條件下，玉米須蘆丁的得率為12.223 mg·g-1，3次重復(fù)的結(jié)果分別為12.143、12.285、12.029 mg·g-1，取平均值為12. 152 mg·g-1，與理論值的誤差為0.93%，這說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化的模型能夠較好地預(yù)測實(shí)際玉米須中蘆丁的含量，并且得出的提取工藝條件較為理想。

2.4玉米須提取物的檢測

2.4.1紫外光譜檢測 將玉米須提取物進(jìn)行紫外光譜檢測，樣品在211.36 nm處有比較尖銳的吸收峰，表明樣品含有-OH、-OCH3或兩個(gè)以上雙鍵的共軛體；在258.62 nm處也有明顯的吸收峰，表明樣品有苯基或苯氧基結(jié)構(gòu)；而樣品在362.65 nm處出現(xiàn)的包峰不表示任何生色基團(tuán)(圖2)。以上數(shù)據(jù)與純品蘆丁檢查結(jié)果及文獻(xiàn)報(bào)道相一致[16-19]。

圖1 各因素交互作用的等高線圖和響應(yīng)面圖Fig.1 Contour map and response surface graph between various factors interaction effects

圖2 紫外光譜檢測結(jié)果Fig.2 Result of UV-spectra

2.4.2紅外光譜檢測 將玉米須提取物進(jìn)行紅外光譜檢測(圖3)，對紅外光譜圖進(jìn)行解析可知，樣品在1 655.52、1 600.37、1 506.68和1 456.88 cm-1等處有多個(gè)吸收峰，這表明是苯環(huán)π鍵共扼體系的C=C鍵伸縮振動(dòng)的存在引起的振動(dòng)吸收峰和α、β-不飽和羰基化合物的伸縮振動(dòng)吸收峰；在3 336.91 cm-1處出現(xiàn)較寬的吸收峰，這表明是可成氫鍵的-OH、配位水或?yàn)榇己头拥牧u基的伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的吸收峰；1 456.88 cm-1是-CH3的彎曲振動(dòng)或是-CH2的剪切式振動(dòng)產(chǎn)生的吸收峰；而947.39、921.78、879.34、808.27、728.76和657.14 cm-1等處的多個(gè)吸收峰，則為芳環(huán)的特征頻率吸收；1 169.25 cm-1是醚的C-O-C伸縮振動(dòng)吸收峰，1 967.54 cm-1是積累雙鍵；1 420～1 300 cm-1是烯烴的C-H面內(nèi)彎曲振動(dòng)，1 000～670 cm-1是烯烴的C-H面外彎曲振動(dòng)。由分析結(jié)果可知，實(shí)驗(yàn)所測得的數(shù)據(jù)與純品蘆丁檢查結(jié)果及文獻(xiàn)報(bào)道相一致[16-19]，這表明本實(shí)驗(yàn)所的最佳工藝下提取的樣品富含蘆丁，實(shí)驗(yàn)所得的最佳提取工藝可靠的。

2.4.3HPLC檢測 選定波長為254 nm，將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品與響應(yīng)面優(yōu)化條件下提取的蘆丁樣品分別進(jìn)行HPLC檢測(圖4)。將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)系列得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線作為色譜峰面積Y，對進(jìn)樣濃度進(jìn)行線性回歸分析可得：Y=70.299X-8.709 9(R2=0.999 2)，范圍為0.375～25 μg·mL-1；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間t=9.625 min，范圍為9.310～11.032 min。優(yōu)化條件下提取的蘆丁樣品在9.457 min時(shí)出峰，峰形對稱，且與標(biāo)樣接近。平均回收率為99.58%、RSD為2.4%，表明精密度良好、重現(xiàn)性好。

圖3 紅外光譜檢測結(jié)果Fig.3 Result of infrared-spectra

圖4 HPLC檢測結(jié)果Fig.4 Result of HPLC

3 結(jié)論

與常規(guī)的溶劑浸提法、滲漉法、煎煮法或回流提取法等相比較，超聲波輔助索氏回流法提取玉米須中的蘆丁具有更好的經(jīng)濟(jì)實(shí)用性和易操作性，同時(shí)還可以縮短提取時(shí)間，節(jié)省能量。由于超聲波用于細(xì)胞內(nèi)部活性成分的提取具有常規(guī)方法不可比擬的優(yōu)勢，因此，超聲波輔助索氏回流法具有很高的應(yīng)用價(jià)值。

試驗(yàn)以單因素篩選為基礎(chǔ)，將Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)的響應(yīng)面法與超聲波振蕩輔助和索氏回流相結(jié)合，將其應(yīng)用于優(yōu)化玉米須中蘆丁提取工藝的研究。結(jié)果表明，該工藝對玉米須中蘆丁的提取影響顯著。此外，本研究還指出了乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、回流時(shí)間以及超聲時(shí)間在玉米須中蘆丁提取過程中的影響不是簡單的線性關(guān)系。因此，響應(yīng)面設(shè)計(jì)比正交設(shè)計(jì)在本類試驗(yàn)中更具優(yōu)越性[20]。目前正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法雖然已被廣泛用于各種藥用植物有效成分的提取工藝中，但正交設(shè)計(jì)只能處理離散水平值，在實(shí)際應(yīng)用中還存在諸多局限性[21]。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)法是用一個(gè)多元二次回歸方程，擬合試驗(yàn)中多個(gè)因子與響應(yīng)值間的關(guān)系，估計(jì)回歸方程的系數(shù)[22-24]，通過對方程求極值來達(dá)到參數(shù)優(yōu)化的目的。

本研究通過單因素篩選考察了乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、超聲時(shí)間、回流時(shí)間、浸泡時(shí)間、超聲溫度、超聲功率和浸提液pH值8組影響蘆丁含量的因素，將經(jīng)過極差分析確定的4組最佳單因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，對玉米須中蘆丁提取的最佳條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定了其最佳工藝的提取條件，即：乙醇體積分?jǐn)?shù)49%、液料比30 mL∶1 g，回流時(shí)間1.7 h以及超聲時(shí)間36 min。在該工藝條件下，玉米須蘆丁的得率為12.152 mg·g-1。通過紅外、紫外光譜檢測以確定提取物的結(jié)構(gòu)，用HPLC檢測進(jìn)一步驗(yàn)證響應(yīng)面法提取工藝的可靠性。經(jīng)檢驗(yàn)證明，該模型合理可靠，能夠較好地預(yù)測試驗(yàn)結(jié)果，能有效減少工藝操作的盲目性，為進(jìn)一步的放大試驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)，對玉米產(chǎn)業(yè)的深加工提供了一定的理論指導(dǎo)。

玉米在我國分布廣泛，而玉米須富含黃酮，有清熱、消腫、降三高、提高機(jī)體免疫力等功效。本試驗(yàn)主要對甘肅省隴中地區(qū)玉米中蘆丁的響應(yīng)面提取工藝及檢測方法進(jìn)行了系列研究，為玉米須這一藥物資源的深層次開發(fā)和利用提供了一定的試驗(yàn)依據(jù)。

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