岳陽(yáng)陽(yáng)，趙貴森，張倩，魯滌，翟仙敦，莫耀南

（1.河南科技大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，河南洛陽(yáng) 471003；2.中國(guó)政法大學(xué)證據(jù)科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100088）

單管一步甲基化可變位點(diǎn)分析技術(shù)

岳陽(yáng)陽(yáng)1，2，趙貴森1，2，張倩1，魯滌2，翟仙敦1，莫耀南1

（1.河南科技大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，河南洛陽(yáng) 471003；2.中國(guó)政法大學(xué)證據(jù)科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100088）

目的建立單管一步甲基化可變位點(diǎn)（methylation variable position，MVP）分析技術(shù)——單管消化后PCR鏈融解曲線分析（post-digestion PCR-melting curve analysis，PDP-MCA）。方法以文獻(xiàn)報(bào)道的差異甲基化區(qū)（differentially methylated region，DMR）為模型，在MVP兩側(cè)設(shè)計(jì)一組解鏈溫度各不相同的引物。應(yīng)用FastDigest甲基化敏感性限制酶（methylation-sensitive restriction enzyme，MSRE），在同一反應(yīng)管內(nèi)順次進(jìn)行DNA的酶切、復(fù)合擴(kuò)增和MCA檢測(cè)，生成MCA圖譜。同時(shí)用該方法和傳統(tǒng)的MSRE-PCR MCA技術(shù)檢測(cè)相同樣品（外周靜脈血、精液、陰道液各5份），比較兩種方法檢測(cè)結(jié)果，驗(yàn)證其可行性，并分析比較不同樣品的MCA/HRM圖譜。結(jié)果解鏈溫度相差2℃以上的片段，MCA峰分離良好，復(fù)合擴(kuò)增后可以用MCA技術(shù)檢測(cè)。應(yīng)用單管PDP-MCA技術(shù)，可以集酶切、擴(kuò)增和檢測(cè)三步于一管，在2h內(nèi)得到與傳統(tǒng)方法一致的特異性圖譜和數(shù)據(jù)，并實(shí)現(xiàn)樣品的快速分類鑒別。結(jié)論單管PDP-MCA技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)多個(gè)MVP的單管、閉管檢測(cè)，具有簡(jiǎn)便、快速、易于自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，可用于樣品DNA甲基化差異的檢測(cè)。

法醫(yī)遺傳學(xué)；DNA甲基化；鏈融解曲線；甲基化敏感性限制酶；甲基化可變位點(diǎn)

DNA甲基化是DNA的一種新型分子標(biāo)記，與SNP等反映個(gè)體間差異的遺傳標(biāo)記不同，主要表現(xiàn)為個(gè)體內(nèi)細(xì)胞間的差異。甲基化可變位點(diǎn)（methylation variable position，MVP）被視為表觀遺傳學(xué)水平上的“SNP”[1]，即DNA鏈上表現(xiàn)出不同甲基化狀態(tài)的CpG位點(diǎn)，這種差異存在于正常的細(xì)胞類型之間以及細(xì)胞的不同發(fā)育階段。基因組內(nèi)廣泛存在的MVP為解決法醫(yī)學(xué)問(wèn)題提供了一種全新的途徑，國(guó)內(nèi)外學(xué)者正在探索利用DNA甲基化標(biāo)記解決同卵雙生子鑒別、年齡推斷、斑痕類型鑒別、人造DNA鑒偽等問(wèn)題[2-8]。細(xì)胞類型的差異導(dǎo)致了不同組織間的特異性甲基化模式即組織特異性差異甲基化區(qū)（differentially methylated region，DMR），因而通過(guò)分析檢材的甲基化特征，就可推斷其組織細(xì)胞類型。

在篩選高鑒別能力標(biāo)記的同時(shí)，還需建立適合法醫(yī)學(xué)檢材特點(diǎn)、足夠便捷、能與當(dāng)代DNA分析技術(shù)相匹配的檢測(cè)方法。常用的應(yīng)用性MVP分析技術(shù)大多操作繁瑣、耗時(shí)費(fèi)力，難以達(dá)到自動(dòng)化、標(biāo)準(zhǔn)化的要求[9-10]。本研究旨在把常用的FastDigest內(nèi)切酶[11]、鏈融解曲線分析（melting curve analysis，MCA）[12-13]與傳統(tǒng)的甲基化敏感性限制酶PCR（methylation-sensitive restriction enzyme PCR，MSRE-PCR）技術(shù)[14-15]結(jié)合起來(lái)，建立一種能在單管內(nèi)連續(xù)進(jìn)行酶切、擴(kuò)增和MCA檢測(cè)的簡(jiǎn)便方法——單管消化后PCR鏈融解曲線分析（post-digestion PCR-melting curve analysis，PDPMCA）技術(shù)，以期實(shí)現(xiàn)多個(gè)MVP的單管、閉管、復(fù)合、快速檢測(cè)，為DNA甲基化標(biāo)記在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用尋求合適的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Rotor-Gene Q 5Plex HRM熒光定量PCR儀（德國(guó)QIAGEN公司），F(xiàn)LA6000微量紫外可見分光光度計(jì)（杭州晶飛科技有限公司），TGL-16B高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

限制酶FastDigest?HhaⅠ、FastDigest?HpaⅡ、普通HhaⅠ、普通HpaⅡ和熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶（加拿大Fermentas公司），20×Eva Green熒光染料（美國(guó)Biotium公司），甜菜堿、二甲基亞砜（美國(guó)Sigma公司）。

1.2 樣品

按知情同意原則收集健康成人外周靜脈血、精液、陰道液各5份。常規(guī)的蛋白酶K消化、酚-氯仿法提取基因組DNA，紫外分光光度法定量，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物

根據(jù)文獻(xiàn)[16-19]報(bào)道的DMR為模型，從Genebank中獲取4個(gè)具有組織特異性的差異甲基化序列MAGE-1、14-3-3σ、MCJ、TIMP，用pDRAW32軟件搜索其中可為限制酶FastDigest?HhaⅠ和HpaⅡ識(shí)別的MVP數(shù)。運(yùn)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，使擴(kuò)增片段內(nèi)至少有1個(gè)MVP，4個(gè)片段的解鏈溫度（melting temperature，Tm）梯度增加。另外設(shè)置一個(gè)擴(kuò)增參照片段AC，不含HhaⅠ和HpaⅡ識(shí)別的MVP，且Tm低于上述4個(gè)片段（表1）。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 擴(kuò)增片段與引物信息

1.4 多重PCR-MCA確定引物組合

常規(guī)PCR法確定各基因座最佳的引物濃度、反應(yīng)體系和循環(huán)參數(shù)。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行組合、優(yōu)化，形成兩套復(fù)合擴(kuò)增體系（A組合為AC、MAGE-1、14-3-3σ 和MCJ，B組合為AC、MAGE-1、MCJ和TIMP），分別檢驗(yàn)其復(fù)合擴(kuò)增后直接進(jìn)行多重MCA檢測(cè)的可行性。

反應(yīng)體系20μL：含熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶1.5U，引物組合A或B（濃度見表1），2×通用反應(yīng)液10 μL（含緩沖離子、MgCl2、dNTPs、EvaGreen、甜菜堿和二甲基亞砜等），20 ng外周靜脈血基因組DNA，加純水至20 μL。在Rotor-Gene Q 5Plex HRM熒光定量PCR儀上順次進(jìn)行擴(kuò)增和MCA分析。

循環(huán)參數(shù)：94℃8min；94℃30s，59℃25s，72℃30s，35個(gè)循環(huán)；72℃5min。MCA分析：從70℃開始，逐步升高溫度至94℃，每步上升0.2℃，Green/HRM通道采集熒光信號(hào)。

保持上述條件不變，分別以源于其他個(gè)體的DNA和各種濃度的DNA（0.5～80 ng）為模板重復(fù)實(shí)驗(yàn)，檢驗(yàn)方法的穩(wěn)定性、靈敏度。

1.5 單管PDP-MCA法

反應(yīng)體系20μL：含F(xiàn)astDigest?HhaⅠ和HpaⅡ各1 μL，引物組合（選擇1.4項(xiàng)中適用于單管PDPMCA技術(shù)的引物組合），待測(cè)樣品基因組DNA 20ng，Taq DNA聚合酶和通用反應(yīng)液同1.4項(xiàng)，加純水至20μL。在Rotor-Gene Q 5Plex HRM熒光定量PCR儀上順次進(jìn)行酶切、擴(kuò)增和MCA分析。

循環(huán)參數(shù)：37℃保溫10 min，后續(xù)步驟和重復(fù)管設(shè)置同1.4項(xiàng)。每批反應(yīng)設(shè)置假酶切對(duì)照管（不加限制酶），以外周靜脈血基因組DNA為模板，用50%甘油2μL代替限制酶，其余條件與酶切管完全相同。

保持上述條件不變，以各濃度外周靜脈血基因組DNA（0.5～80ng）為模板重復(fù)實(shí)驗(yàn)，測(cè)試方法的靈敏度。

1.6 傳統(tǒng)MSRE-PCR MCA法

按照產(chǎn)品說(shuō)明書，基因組DNA用普通HhaⅠ、普通HpaⅡ酶切8 h，取相當(dāng)于20 ng基因組DNA的酶切物進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增和MCA分析。除不含限制酶、略去37℃保溫步驟外，PCR體系和循環(huán)參數(shù)同1.5項(xiàng)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

Rotor-Gene 2.0.2.4軟件分析數(shù)據(jù)生成MCA圖譜，用Origin8的Peak Analyzer模塊進(jìn)行基線扣除和峰積分計(jì)算，Statistics模塊進(jìn)行峰參數(shù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)描述和配對(duì)t檢驗(yàn)。比較兩種方法所得基因片段的峰面積占MCA曲線下總面積的百分比。

2 結(jié)果

2.1 多重PCR-MCA圖譜

以外周靜脈血基因組DNA為模板，經(jīng)調(diào)整引物濃度，優(yōu)化反應(yīng)體系和循環(huán)參數(shù)，表1中的基因座均可以實(shí)現(xiàn)特異擴(kuò)增（圖1A、1B），并且可以分成A、B兩個(gè)組合進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增（圖1C、1D）。

A組合4個(gè)片段（AC、MAGE-1、14-3-3σ和MCJ）分管同步擴(kuò)增時(shí)，MCA圖譜均呈單一的主峰，且片段之間的MCA峰主體上互不重疊（圖1A）；單管復(fù)合擴(kuò)增時(shí)，MCA圖譜呈4個(gè)分離良好的峰，與4個(gè)片段相對(duì)應(yīng)（圖1C）。以源于不同個(gè)體的基因組DNA重復(fù)測(cè)定，只要模板量在1～40 ng，各片段的峰位置偏離在0.2℃以內(nèi)，小于相鄰峰間距的1/10。

B組合（AC、MAGE-1、MCJ和TIMP）中MCJ和TIMP的MCA峰相互交疊（圖1B）；單管復(fù)合擴(kuò)增時(shí)，與二者相應(yīng)的峰呈雙頭寬峰或肩峰狀，且TIMP的MCA峰較分管同步擴(kuò)增時(shí)右移0.5℃以上（圖1D）。故B組合不適用于單管PDP-MCA技術(shù)。

2.2 單管PDP-MCA法的建立

圖1 Tm差異片段的多重PCR-MCA圖譜

以2.1項(xiàng)多重PCR-MCA檢測(cè)為基礎(chǔ)，在反應(yīng)體系內(nèi)引入FastDigest?HhaⅠ、FastDigest?HpaⅡ、引物A組合、啟動(dòng)擴(kuò)增前增加一個(gè)37℃保溫10min的酶切步驟，即為單管PDP-MCA法。用該技術(shù)檢測(cè)并生成精液、血液和陰道液各有其特異的MCA圖譜。與未加限制酶的假酶切對(duì)照管相比較，組成樣品MCA圖譜的各MVP峰的位置不變，但峰高、峰面積呈組織特異性變化（圖2）。這種變化與傳統(tǒng)MSRE-PCR MCA法得到的結(jié)果一致（表2），精液的MAGE-1和14-3-3σ甲基化程度低于血液和陰道液，而陰道液的MCJ甲基化程度高于精液和血液，血液、精液樣品的MCJ峰高均小于0.1（圖2）。除14-3-3σ基因座外，各樣品用兩種方法的檢測(cè)結(jié)果比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表2）。當(dāng)前實(shí)驗(yàn)條件下，1 ng的基因組DNA可獲得穩(wěn)定的MCA圖譜。加入的基因組DNA 在1～40ng，不影響圖譜的特異性。

在可進(jìn)行高分辨率融解曲線（high resolution melting，HRM）的儀器上，用HRM模式進(jìn)行MCA分析，除生成MCA圖譜外，得到的數(shù)據(jù)還可以用儀器配備的HRM軟件處理，得到標(biāo)準(zhǔn)和差異HRM圖譜，便于比較樣品間的差異（圖3）。

圖2 不同組織來(lái)源樣品的單管PDP-MCA圖譜

表2 單管PDP-MCA法與傳統(tǒng)MSRE-PCR MCA法結(jié)果比較（n=5，±s，%）

表2 單管PDP-MCA法與傳統(tǒng)MSRE-PCR MCA法結(jié)果比較（n=5，±s，%）

注：表中數(shù)值為各基因片段的峰面積占MCA曲線下總面積的百分?jǐn)?shù)

MCAPDP-MCAMSRE-PCR MCA對(duì)照15.67±2.3014.79±1.1018.40±1.4519.90±0.6044.56±1.6944.53±0.6018.51±1.4317.14±0.99血液25.72±1.4524.14±1.7526.07±0.6126.57±4.5943.21±2.4943.12±2.510.67±0.401.01±0.55精液42.59±1.6941.52±2.3417.11±1.6818.19±1.8334.65±3.6631.20±1.311.44±0.623.55±0.73陰道液19.23±1.8221.60±0.9326.57±1.6227.65±2.8243.41±3.1638.82±0.625.44±1.476.32±0.78樣品ACMAGE-114-3-3σMCJ PDP-MCAMSRE-PCR MCAPDP-MCAMSRE-PCR MCAPDP-MCAMSRE-PCR

圖3 樣品特異性的HRM圖譜

3 討論

3.1 原理

FastDigest內(nèi)切酶是一種新型的限制酶，具有高效、快速、模板和體系適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在PCR緩沖體系內(nèi)也可以實(shí)現(xiàn)靶位點(diǎn)的有效切割[11]。直接把這種限制酶加入PCR體系，只需在常規(guī)擴(kuò)增前37℃保溫10min，即可替代傳統(tǒng)的酶切步驟。實(shí)現(xiàn)酶切和擴(kuò)增兩個(gè)反應(yīng)在同一體系、同一管內(nèi)的連續(xù)進(jìn)行。

MCA是一種根據(jù)融鏈曲線的特征來(lái)鑒別DNA片段的電泳替代技術(shù)。與根據(jù)長(zhǎng)度差異性來(lái)分離檢測(cè)的電泳方法不同，MCA是一種基于解鏈溫度差異的均相閉管分析技術(shù)[13]。PCR體系內(nèi)如含有EvaGreen等雙鏈DNA熒光染料，在定量PCR儀上完成擴(kuò)增后，只需在梯度升溫的同時(shí)采集熒光信號(hào)，就可得到特異性的MCA圖譜，即時(shí)提供靶片段的有無(wú)、產(chǎn)量及純度等類似電泳檢測(cè)的信息。復(fù)合擴(kuò)增時(shí)，只要多個(gè)片段之間的解鏈溫度互不重疊，可以同時(shí)獲得各片段的信息并進(jìn)行相互比較[12]。

同時(shí)采用FastDigest內(nèi)切酶和復(fù)合MCA技術(shù)，就可以把傳統(tǒng)MSRE-PCR MCA的酶切、擴(kuò)增和產(chǎn)物分析3個(gè)步驟集成于一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)，實(shí)現(xiàn)多個(gè)MVP的單步閉管快速檢測(cè)。

3.2 可行性

為了驗(yàn)證上述原理或設(shè)計(jì)思路的可行性，本研究以文獻(xiàn)[16-19]報(bào)道的DMR為模型，成功建立了單管PDPMCA法。

從DMR中篩選含有MVP的可擴(kuò)增片段，是建立該技術(shù)的前提。本研究運(yùn)用兩種最常見的MSRE酶（HhaⅠ和HpaⅡ）設(shè)計(jì)并合成4個(gè)片段的引物（表1）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，成功實(shí)現(xiàn)了運(yùn)用引物A組合4個(gè)片段的單管PDP-MCA檢測(cè)。綜合上述序列分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的結(jié)果，應(yīng)用MSRE-PCR MCA法來(lái)進(jìn)行MVP分析是可行的。同時(shí)，考慮到還有多種可用的MSRE酶及引物改進(jìn)的可能性，多數(shù)DMR都可以找到符合設(shè)計(jì)要求的MVP，即該技術(shù)具有一定的實(shí)際應(yīng)用前景。

FastDigest內(nèi)切酶的應(yīng)用是本研究的另一重要改進(jìn)。為了驗(yàn)證其在PCR體系內(nèi)的切割效果，本研究比較了單管PDP-MCA法和傳統(tǒng)MSRE-PCR MCA法對(duì)同一組基因組樣品的檢測(cè)結(jié)果。兩種方法的MCA圖譜及峰積分?jǐn)?shù)據(jù)（表2）均有良好的一致性，所反映的組織細(xì)胞甲基化特征也與文獻(xiàn)[16-19]報(bào)道相同。

只有在14-3-3σ基因座上，兩種方法的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），可能系陰道液（樣本收集困難，檢材質(zhì)量偏低）DNA樣品的純度較低所致，有待進(jìn)一步分析確認(rèn)。改進(jìn)后的方法總體上可以達(dá)到傳統(tǒng)的檢測(cè)效果，實(shí)現(xiàn)MVP的簡(jiǎn)便快速分析，用于組織細(xì)胞之間甲基化差異的比較（圖2～3）。

應(yīng)用本研究建立的單管PDP-MCA技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，血液、精液和陰道液各有其特征性的圖譜（圖2～3），說(shuō)明本技術(shù)具有解決法醫(yī)學(xué)斑痕類型鑒別等實(shí)際問(wèn)題的潛力。本課題組正在對(duì)更多的斑痕特異性MVP進(jìn)行優(yōu)選組合，以期建立一種符合法醫(yī)學(xué)應(yīng)用要求的斑痕單管PDP-MCA鑒別技術(shù)。

3.3 優(yōu)勢(shì)與問(wèn)題

與傳統(tǒng)的MSRE-PCR MCA法及其他基于DNA修飾的甲基化分析方法相比較，單管PDP-MCA技術(shù)的突出優(yōu)勢(shì)是簡(jiǎn)便快速。該技術(shù)只需配制一次反應(yīng)體系即可實(shí)現(xiàn)DNA樣品的甲基化分析，不需反復(fù)移液、換管及電泳操作，結(jié)束后可直接得到多種數(shù)字化的圖譜和相應(yīng)的數(shù)據(jù)。在大幅降低操作量的同時(shí)，也降低了出錯(cuò)和污染的機(jī)會(huì)，并使整個(gè)檢測(cè)過(guò)程有可能實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化。同時(shí)，檢測(cè)時(shí)間大為縮短。

當(dāng)然，要作為一種實(shí)用的方法，單管PDP-MCA法在諸多方面尚需繼續(xù)完善優(yōu)化。首先，受可利用溫度范圍的限制，即使采用分辨率高的HRM技術(shù)，單色熒光MCA檢測(cè)可以復(fù)合的片段數(shù)目理論上很難超過(guò)10個(gè)。有必要繼續(xù)探討利用各種熒光探針或探針染料組合的多色MCA技術(shù)，以增加單次檢測(cè)的信息量[20]。其次，單管PDP-MCA的反應(yīng)體系要兼顧酶切、擴(kuò)增和熒光MCA檢測(cè)3個(gè)方面的要求，應(yīng)繼續(xù)探討優(yōu)化各緩沖組分及反應(yīng)組分的類型和濃度，引入對(duì)酶切效果進(jìn)行控制的片段，以確立真正高效、靈敏、可靠的實(shí)用性方案。

需要指出的是，單管PDP-MCA法進(jìn)行的是復(fù)合擴(kuò)增、復(fù)合MCA和終點(diǎn)檢測(cè)，MCA峰與相應(yīng)MVP的甲基化水平之間有相關(guān)性，但并非定量關(guān)系。樣品MCA圖譜的特異性是由所檢測(cè)的MVP共同決定的，其特征體現(xiàn)在圖譜內(nèi)各MVP峰之間的比例關(guān)系。未經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的參數(shù)，在樣品間并沒有可比性。因此，在設(shè)置反應(yīng)時(shí)，須使用熱啟動(dòng)聚合酶，并注意控制PCR循環(huán)次數(shù)，防止引物二聚體等非特異性產(chǎn)物的形成，以保持MVP片段的融鏈峰與其甲基化水平之間的相關(guān)性。

在分析利用數(shù)據(jù)，對(duì)樣品圖譜的特征進(jìn)行數(shù)字化描述或建立判別標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，對(duì)于MCA圖譜，可以采用峰高比、峰面積比、峰面積百分比等，適用于沒有HRM功能的定量PCR儀，須借助其他軟件對(duì)MCA數(shù)據(jù)作進(jìn)一步處理。在有HRM功能的定量PCR儀上，可用HRM代替MCA，直接得到標(biāo)準(zhǔn)和差異HRM圖譜，既直觀呈現(xiàn)樣品間的差異（圖3），又可直接以若干特征溫度點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)熒光信號(hào)值為參量進(jìn)行判別分析。

本研究用FastDigest內(nèi)切酶和MCA技術(shù)對(duì)傳統(tǒng)的MSRE-PCR MCA法進(jìn)行改良，初步建立了一種簡(jiǎn)便、快速、易于自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化的DNA甲基化分析技術(shù)。對(duì)于DNA樣品，該技術(shù)可以在2 h內(nèi)完成多個(gè)MVP的綜合評(píng)估，即時(shí)生成樣品特異性的MCA-HRM圖譜。適用于各種根據(jù)DNA甲基化差異對(duì)樣品進(jìn)行歸類或鑒別的研究與應(yīng)用。

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One-step Methylation Variable Position Analysis Technology in Single-tube

YUE Yang-yang1,2,ZHAO Gui-sen1,2,ZHANG Qian1,LU Di2,ZHAI Xian-dun1,MO Yao-nan1
（1.School of Forensic Medicine,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China;2.Key Laboratory of Evidence Science,China University of Political Science and Law,Ministry of Education,Beijing 100088,China）

ObjectiveTo develop the single-tube one-step methylation variable position（MVP）analysis technology——single-tube post-digestion PCR-melting curve analysis（PDP-MCA）.MethodsBased on differentially methylated region（DMR）reported previously as the model,a set of primers with different melting temperatures of products in the two sides of MVP were designed.By using the FastDigest methylation-sensitive restriction enzyme（MSRE）,DNA digestion,multiplex amplification,MCA detection and MCA profiles were performed in a single reaction tube.Same samples（peripheral venous blood,semen, and vaginal fluid,5 samples each type）were tested by single-tube one step MVP and traditional MSREPCR MCA technology.To verify the feasibility of this method,the results were compared with that of the traditional technology.The MCA/HRM profiles of different samples were analyzed and compared.ResultsWhen the melting temperature of the fragments had a differential of 2℃,the MCA melting peaks separated well,and MCA detection after multiplex amplification was successful.The single-tube PDP-MCA assay was developed,which integrated multiple reactions（digestion,amplification and detection）into one tube.By this method,the sample-specific profiles and data were analyzed in 2h,which is similar to that of the traditional method.The rapid classifications of the samples were also realized.ConclusionMultiplex MVPs can be analyzed in a single closed-tube.The single-tube PDP-MCA technology is a simple,fast,and automatable method.It can be used for detection of DNA methylation variations.

forensic genetics;DNA methylation;melting curve;methylation-sensitive restriction enzyme; methylation variable position

DF795.2

10.3969/j.issn.1004-5619.2013.06.005

1004-5619（2013）06-0419-06

2012-04-26）

（本文編輯：柳燕）

《法醫(yī)學(xué)雜志》常用主題詞（六）

檢索詞主題詞英文串聯(lián)質(zhì)譜法串聯(lián)質(zhì)譜法tandem mass spectrometry氣相色譜-質(zhì)譜法/氣液體色譜法-質(zhì)量光譜測(cè)定法/色譜法，氣液質(zhì)量光譜測(cè)定法/色譜法，氣質(zhì)量光譜測(cè)定法/質(zhì)量光譜測(cè)定法-氣相色譜法氣相色譜-質(zhì)譜法gas chromatography-mass spectrometry氣相色譜法色譜法，氣相chromatography，gas色譜法，高速液相/色譜法，高效液相/色譜法，高壓液相色譜法，高壓液相chromatography，high pressure liquid色譜法，液相/液相色譜法色譜法，液相chromatography，liquid間質(zhì)性肺疾病/肺炎，間質(zhì)性/肺炎，間質(zhì)肺疾病，間質(zhì)性lung diseases，interstitial肺疾病，阻塞性肺疾病，阻塞性lung diseases，obstructive慢性阻塞性肺疾病/慢性阻塞肺疾病肺疾病，慢性阻塞性pulmonary disease，chronic obstructive創(chuàng)傷性膈疝疝，橫膈，創(chuàng)傷性hernia，diaphragmatic，traumatic膈疝疝，橫膈hernia，diaphragmatic腹內(nèi)疝疝，腹部hernia，abdominal動(dòng)脈瘤樣骨囊腫骨囊腫，動(dòng)脈瘤樣bone cysts，aneurysmal胃癌胃腫瘤stomach neoplasms骨髓移植/骨髓細(xì)胞移植/移植，骨髓/移植，骨髓細(xì)胞/移植術(shù)，骨髓骨髓移植bone marrow transplantation

證據(jù)科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（中國(guó)政法大學(xué)）開放基金資助項(xiàng)目（08KFKT002）

岳陽(yáng)陽(yáng)（1988—），男，陜西興平人，碩士研究生，主要從事法醫(yī)分子遺傳學(xué)研究

趙貴森，男，副教授，主要從事法醫(yī)遺傳學(xué)研究；E-mail：lyfy@haust.edu.cn