張 遠(yuǎn)，黎 鋼，孫圣剛，喬 嫻

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)影響了全球1.5×107萬人次，深入了解神經(jīng)元變性死亡的機(jī)制并找到能夠延緩或阻斷該靶點(diǎn)的藥物是AD研究的核心問題。近年來神經(jīng)鞘脂(sphingolipid)代謝異常與Aβ 的神經(jīng)毒性作用受到諸多研究者的關(guān)注［1～6］。最早研究發(fā)現(xiàn)AD 患者腦標(biāo)本中神經(jīng)酰胺神經(jīng)酰胺(ceramide，Cer)含量增增高，He［7］等的研究發(fā)現(xiàn)與正常死亡腦組織標(biāo)本相比較，AD 患者腦標(biāo)本的額顳區(qū)灰質(zhì)參與神經(jīng)鞘磷脂(sphingomyelin，SM)、Cer 代謝的酸性神經(jīng)鞘磷脂酶及神經(jīng)酰胺酶活性增強(qiáng)，這導(dǎo)致SM 下降、Cer 含量增高、鞘氨醇(sphingosine，Sph)含量增高，但1-磷酸鞘氨醇(sphingosine1-phospate，s1p)含量下降。在此基礎(chǔ)上我們構(gòu)建了sphk1-siRNA 腺病毒載體，并將其通過立體定位注射的方法轉(zhuǎn)染至APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因AD模型鼠海馬。前期研究發(fā)現(xiàn)老年斑沉積增多，行為學(xué)損害程度顯著惡化［8］，轉(zhuǎn)染后APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬組織凋亡程度明顯增加［9］。在此基礎(chǔ)上我們研究了sphk1-siRNA 轉(zhuǎn)染后對小鼠海馬DG 區(qū)神經(jīng)元的影響，現(xiàn)將結(jié)果匯報(bào)如下。

1 材料與方法

1.1 重組腺病毒載體sphk1-siRNA 的構(gòu)建重組質(zhì)粒pDC316 sphk1-siRNA 的構(gòu)建及病毒載體的構(gòu)建由上海吉?jiǎng)P生物科技有限公司完成，具體如下:兩個(gè)編碼人類sphk1(GenBank:NM_011451)的序列分別作為siRNA 靶序列和作為陰性對照的非定位導(dǎo)向序列。使用NCBI 數(shù)據(jù)庫篩選，以確保siRNA 靶序列只有sphk1 基因?yàn)槟繕?biāo)序列。這些寡核苷酸退火形成雙鏈并通過T4 DNA 連接酶將pDC316 載體克隆至U6 啟動(dòng)子的下游，并使用BamHⅠ和HindⅢ生成pDC316-sphk1 siRNA 載體。然后將pDC316-sphk1-siRNA 載體轉(zhuǎn)染至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α 中，使轉(zhuǎn)染后的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α 平鋪在含有20mg/ml 卡那霉素的LB-瓊脂板的表面。通過瓊脂糖凝膠電泳PCR 擴(kuò)增以確定并挑取陽性克隆，然后通過使用3730 DNA 測序儀(ABI、CA、USA)對陽性菌落進(jìn)行序列分析。轉(zhuǎn)染前24h，HEK 293 細(xì)胞被培養(yǎng)在密度為1.5×106個(gè)/60mm2的培養(yǎng)板上。根據(jù)Lipofectamine2000 的使用說明，將重組腺病毒質(zhì)粒和其它輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HEK 293 細(xì)胞。10～15d 后，細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)逐漸明顯，貼壁細(xì)胞變得圓潤和消融。收集上清液及細(xì)胞并在37℃/～70℃反復(fù)凍融3 次。含有病毒載體的上清液于4℃以7000 轉(zhuǎn)/min 離心5min 后，使用byAdeno-XTM 純化試劑盒進(jìn)行純化，然后保存在－70℃?zhèn)溆?。斑點(diǎn)法檢測重組病毒的滴度［9］。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理標(biāo)準(zhǔn)的指導(dǎo)，11 個(gè)月年齡的APPsw/PS1(APP/PS1)雙轉(zhuǎn)基因小鼠(由南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所提供)(n=12)和野生型小鼠組(n=6)飼養(yǎng)在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房。在用12h 光照和12 個(gè)黑暗循環(huán)的恒溫環(huán)境中，每籠3 只。動(dòng)物根據(jù)自身需要自由采食食物和水。其中注射sphk1-siRNA 者為siRNA 組，注射生理鹽水者為生理鹽水組，同型野生型小鼠為陰性對照組(n=6)。

1.3 立體定位注射法 APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠及同型野生型小鼠經(jīng)10%水合氯醛0.6ml/kg 麻醉后，固定于攜帶0.5μl 漢密爾頓微量注射器的腦立體定位儀上。頭頂部去毛，消毒皮膚，沿正中切口，經(jīng)雙氧水消毒后，充分暴露前囟。根據(jù)小鼠腦立位圖譜，于前囟后1.9mm、中-外左右各1.4mm、背-腹上下1.5mm 處，向雙側(cè)海馬緩慢注入1.5μl/位點(diǎn)(1×1011PFU/ml)的sphk1-siRNA 載體、生理鹽水及rAd-GFP，每側(cè)注射時(shí)間5min。后將針頭留在原先的位置60s 使溶液遠(yuǎn)離針尖并充分?jǐn)U散，緩慢退針。皮膚切開處用青霉素抗菌，縫合傷口。待小鼠蘇醒后送回動(dòng)物房飼養(yǎng)，密切觀察小鼠的變化。

1.4 Western-blot 法 取出海馬后，稱量剪碎。加入400μl 單去污劑裂解液(含PMSF)，充分勻漿。4℃下12000rpm 離心5min。BCA 計(jì)算出蛋白濃度，配制10%的分離膠10ml 及4%的濃縮膠5ml，4℃電壓12V 轉(zhuǎn)膜過夜;再加入5μl 一抗，室溫下在搖床上緩慢搖動(dòng)1h，再加入PVDF 膜與辣根過氧化物酶抗小鼠二抗(1∶5000)37℃孵育1h;5%脫脂奶粉(含0.05%Tween 20)洗3 次。ECL 化學(xué)發(fā)光法:在暗室中，按照1∶1 的比例等量混合ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒中的A、B 兩液，混勻后立即滴加于PVDF 膜表面(注意:濾膜的蛋白面應(yīng)朝上)，室溫下孵育1～2min，然后用濾紙吸干濾膜表面多余的液體，將濾膜夾入透明塑料袋中，EPSON 彩色圖像掃描儀掃描成圖像文件并用Kodak Digital Science ID2.0 分析軟件分析條帶的灰度值，計(jì)算同一份標(biāo)本的PAR-1 和PAR-2 蛋白與actin 蛋白灰度值的比值以對蛋白表達(dá)進(jìn)行半定量分析。

1.5 免疫熒光法顯微鏡觀察 腹腔灌注4%的多聚甲醛及生理鹽水后分離腦組織，并將其在4%多聚甲醛中固定，待腦沉底后用冰凍切片機(jī)切片，厚度為10～12μm，膠水固定在載玻片上。后將玻片浸入4%多聚甲醛中固定10min，再用0.01 PBS漂洗5min×3 次。然后0.2% Triton X100(20%Triton X100+0.01PBS 100ml)室溫孵育30min，以增加細(xì)胞的通透性，PBS 清洗5min×3。并用5%胎牛血清(BSA)的0.01mol/L PBS 封閉20min，室溫孵育20min。倒掉封閉液，加入一抗 sphk1(羊抗，1∶150)，放入濕盒，37℃孵育，1h 后轉(zhuǎn)入4℃過夜，PBS 漂洗5min×3 次后加入羅丹明標(biāo)記的二抗(兔抗，1∶100)，37℃，1h。然后再次加入一抗Abeta(兔抗，1∶200)，37℃孵育，1h 后轉(zhuǎn)入4℃過夜，0.01PBS 漂洗5min×3 次并加入Dylight 405 藍(lán)色熒光二抗(羊抗，1∶100)，37℃，2h。PBS 漂洗5min×3次后，使用碳酸甘油緩沖液封片，并用激光共聚焦顯微鏡觀察(Olympus、Tokyo、Japan)進(jìn)行觀察。

1.6 電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察 將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)10%水合氯醛6ml/kg 腹腔麻醉后，按常規(guī)經(jīng)左心室升主動(dòng)脈灌注固定;然后開顱取腦，剝離海馬。置入4℃的2.5%電鏡專用戊二醛溶液中固定2h;后使用0.1 mol PBS 漂洗2 次，10min/次;再用1%四氧化鋨后固定2h;后丙酮梯度脫水，浸透、包埋、固化;并采用半薄切片定位及超薄切片，鈾染，鉛染，最后行電鏡(Hitachi H-7500)觀察。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 13.0 軟件(SPSS Inc，USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。平均值的比較采用t 檢驗(yàn)，P＜0.05其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 sphk1-siRNA 對APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因AD模型鼠海馬超微結(jié)構(gòu)的影響 轉(zhuǎn)染后1 個(gè)月，我們對siRNA 組、生理鹽水組、陰性對照組小鼠海馬組織行電鏡檢查。結(jié)果如圖1 所示:圖A 相對于圖C來說核質(zhì)變空和部分神經(jīng)元胞質(zhì)變空，但線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)整齊。圖B 相對于圖C 來說可見微絲和微管消失，細(xì)胞核核質(zhì)減少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凌亂，神經(jīng)元不飽滿。由此可見成功轉(zhuǎn)染sphk1-siRNA 后，海馬超微結(jié)構(gòu)變性程度加重(見圖1)。

2.2 sphk1-siRNA 對APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因AD模型鼠海馬DG 區(qū)新生神經(jīng)元的影響 為了進(jìn)一步檢測sphk1-siRNA 轉(zhuǎn)染后對小鼠DG 區(qū)新生神經(jīng)元的影響，我們采用激光共聚焦的方法對其進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示:陰性對照組小鼠DG 區(qū)可見新生神經(jīng)元形成，但是生理鹽水組及siRNA 組未見明顯新生神經(jīng)元形成。由此可見siRNA 組及生理鹽水組小鼠突觸神經(jīng)元再生功能受到抑制(見圖2)。

2.3 sphk1-siRNA 對APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因AD模型鼠海馬組織s1P 受體的影響 由于s1p 通過G蛋白偶聯(lián)發(fā)揮其生物學(xué)作用且影響突觸后遞質(zhì)的傳遞，所以我們采用real-time PCR 對小鼠是s1p 受體(s1pr)進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)siRNA 組s1pr1 表達(dá)明顯低于其他兩組，而s1pr3 表達(dá)則明顯高于其他兩組。

2.4 sphk1-siRNA 對APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因AD模型鼠突觸后膜蛋白SNAP-25 表達(dá)的影響 為了進(jìn)一步證實(shí)sphk1 表達(dá)下降后對突觸后神經(jīng)元的影響，我們采用Western-blot 的方法對APP/PS1 突觸后膜蛋白SNAP-25 進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示siRNA 組SNAP-25 表達(dá)明顯低于其他兩組。

3 討論

阿爾茨海默病是一種最常見的漸進(jìn)性大腦退行性病變，其發(fā)病率隨年齡增長逐漸增高。臨床上主要表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙。而其主要的神經(jīng)病理學(xué)以β 淀粉樣蛋白(amyloid beta-protein，Aβ)沉積為核心的老年斑、神經(jīng)元內(nèi)的神經(jīng)原纖維纏結(jié)和明顯的膠質(zhì)化為特征。迄今其確切的病因和發(fā)病機(jī)制尚未充分闡明，尚無有效的根治良策。

神經(jīng)鞘脂(sphingolipid)代謝物包括神經(jīng)鞘磷脂、神經(jīng)酰胺、鞘氨醇和1-磷酸鞘氨醇等多種代謝產(chǎn)物，目前研究發(fā)現(xiàn)這些磷脂的代謝產(chǎn)物參與細(xì)胞增殖與凋亡的調(diào)控。Cer 和Sph 是細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控子，能夠抑制細(xì)胞生長、促進(jìn)細(xì)胞凋亡;而其下游的代謝物s1p 則刺激細(xì)胞生長、抑制細(xì)胞凋亡［10］。S1p 既是細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的信使分子，又可以分泌至細(xì)胞外并通過細(xì)胞表面的s1p 受體發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。細(xì)胞內(nèi)Cer、Sph 和s1p 的水平通過酶促反應(yīng)維持動(dòng)態(tài)平衡，從而維持細(xì)胞的生理功能并決定細(xì)胞的生存和凋亡，因此，有人將由Cer、Sph 和s1p 共同構(gòu)成的動(dòng)態(tài)體系形象地稱作“鞘磷脂變阻器”(sphingolipic rheostat)［5］。鞘氨醇激酶是“鞘磷脂變阻器”的關(guān)鍵調(diào)節(jié)子。sphk1 將Sph 轉(zhuǎn)化成s1p，不僅能夠增加促生長、抗凋亡的信號分子s1p 水平，而且能夠減少促凋亡的Cer 和Sph 的水平。因此sphk1 是維持細(xì)胞內(nèi)上述物質(zhì)平衡的重要限速酶，也是細(xì)胞增殖及存活的重要調(diào)控因子［10］。

突觸功能障礙常發(fā)生在AD 病理改變的早期且為具有標(biāo)志性的改變。Aβ 沉積導(dǎo)致網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)異常興奮和涉及學(xué)習(xí)和記憶通路代償性的抑制反應(yīng)，這些改變都會促進(jìn)認(rèn)知能力下降［11］。研究發(fā)現(xiàn)s1p參與少突膠質(zhì)細(xì)胞［12］、中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘細(xì)胞［5］的生長和存活以及調(diào)節(jié)神經(jīng)元的興奮性［13］。海馬神經(jīng)元中的s1p 通過s1p 受體來促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放［14］，且與s1p 受體偶聯(lián)的G 蛋白與激活下游信號通路不同效應(yīng)的分子具有不同的親和力［15］。S1pr1可以調(diào)節(jié)神經(jīng)軸突的形成/延伸，s1pr3 則剛好起著相反的作用［16］。例如，sphk1 的激活和s1p 的形成可以保護(hù)中腦神經(jīng)元免受谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性的影響［17］。多巴胺誘導(dǎo)的谷氨酸鹽的釋放依賴于sphk1 的激活及s1p 的形成以及相應(yīng)的s1p 受體的產(chǎn)生，表明s1p 通過其自分泌的作用促進(jìn)海馬神經(jīng)元中谷氨酸的分泌［15］。

綜上所述，s1p 的形成可以通過上調(diào)s1p 和它的受體的表達(dá)提高突觸的活性。我們的研究表明，sphk1-siRNA 轉(zhuǎn)染后神經(jīng)酰胺減少的同時(shí)促進(jìn)s1p 的產(chǎn)生具有重要意義。同時(shí)，Aβ 寡聚體病理性的沉積抑制了突觸興奮性的傳遞，但也引發(fā)了神經(jīng)回路和網(wǎng)絡(luò)異常的癇樣放電模式［18］。SNAP-25 作為突觸后膜SNARE 復(fù)合體組成之一，在sphk1-siRNA 轉(zhuǎn)染后表達(dá)明顯減少，從另一方面說明了突觸活性下以及學(xué)習(xí)和記憶能力顯著惡化的原因。

由此可見，sphk1-siRNA 轉(zhuǎn)染后抑制了APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬DG 區(qū)神經(jīng)元的再生及突觸的功能，這進(jìn)一步豐富并完善了之前的研究，揭示了sphk1基因沉默后APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠行為學(xué)障礙加重的原因，同時(shí)也為進(jìn)一步探索sphk1 高表達(dá)逆轉(zhuǎn)阿爾茨海默病雙轉(zhuǎn)基因模型鼠病理改變提出了新的可能。

圖1 轉(zhuǎn)染Sphk1-siRNA 后海馬超微結(jié)構(gòu)的改變

圖2 轉(zhuǎn)染Sphk1-siRNA 后海馬DG 區(qū)神經(jīng)元的改變

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