井 沆，肖 雁，官志忠

血管性癡呆(vascular dementia，VaD)是老年期癡呆的主要類型之一，是由一系列腦血管因素(腦組織梗死、低灌注或出血等)導(dǎo)致腦組織損害引起的以認(rèn)知功能障礙為特征的綜合征［2］。關(guān)于血管性癡呆的眾多發(fā)病機(jī)制中鈣超載學(xué)說占主流地位，鈣超載后引起鈣信號(hào)通路的過度激活從而觸發(fā)了Ca2+依賴的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷甚至死亡［3］。一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase，NOS)是此通路中的一個(gè)關(guān)鍵酶，NOS 是催化L-精氨酸產(chǎn)生NO 和L-胍氨酸的專一酶［4］，NOS 有2 種類型:誘導(dǎo)型NOS(inducible nitric oxide synthase，iNOS)和結(jié)構(gòu)型NOS(constitutive nitric oxide synthase，cNOS)，有研究表明iNOS 參與了VaD 引起的遲發(fā)性腦損傷［5］。本實(shí)驗(yàn)首先觀察NOS 和NO 在VaD 模型大鼠和假手術(shù)大鼠血清及海馬中的表達(dá)，然后對(duì)造模后1月組和造模后2 月組的NOS 和NO 結(jié)果進(jìn)行分析，探討NOS 和NO 在造模不同時(shí)間段的表達(dá)差異，探討其在VaD 發(fā)病進(jìn)程中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 成年健康SD 大鼠60 只(購(gòu)自重慶第三軍醫(yī)大)，體重200～250g，雌雄各半，隨機(jī)分為模型組和假手術(shù)組。

1.1.2 試劑 NOS、NO 試劑盒由南京建成生物工程公司提供。鼠抗β-actin 單克隆抗體、鼠抗NOS 單克隆抗體、HRP 標(biāo)記的抗鼠二抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司。5×蛋白上樣緩沖液，RIPA 裂解液，SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒均購(gòu)于碧云天生物試劑公司。聚乙烯二氟(PVDF)膜、ECL-Plus 發(fā)光試劑、高效顯影膠片購(gòu)于Amersham 公司。顯影液、定影液購(gòu)于柯達(dá)公司。BCA 法蛋白定量測(cè)試盒購(gòu)于上海捷瑞生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物篩選及分組 60 只SD 大鼠，雌雄各半。適應(yīng)性喂養(yǎng)1w 后，進(jìn)行Morris 水迷宮定向航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)［6］，第1～4 天進(jìn)行定向航行試驗(yàn):每日將大鼠按Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限順序從各入水點(diǎn)靠池壁放入水中，記錄60s 內(nèi)大鼠從入水到爬上平臺(tái)(固定于第象限)所需時(shí)間即逃避潛伏期。每只大鼠每天訓(xùn)練4 次。第5 天撤去平臺(tái)，進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn):記錄大鼠2min 內(nèi)穿過原站臺(tái)位置的次數(shù)。選取學(xué)習(xí)、記憶力相近的大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組與VaD模型組，模型組再分1 月組及2 月組，每組15 只。

1.2.2 大鼠VaD 模型的制備［7］大鼠術(shù)前12h 禁食，4h 禁水。大鼠稱重后用10% 水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔注射，麻醉成功后俯臥位固定、備皮、碘伏和75%乙醇消毒，行背側(cè)頸正中切口，暴露雙側(cè)第一頸椎橫突翼小孔，用直徑0.5mm 電凝針插入雙側(cè)翼小孔凝閉雙側(cè)椎動(dòng)脈，逐層整理好皮下組織，局部傷口縫合前涂以適量青霉素粉以防止感染，間斷縫合皮膚。24h 后行頸前正中切口，分離各層組織暴露雙側(cè)頸動(dòng)脈后穿線待用，拉起穿線用微動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈5min，共夾閉3 次，每次間隔1h。假手術(shù)組只分離椎動(dòng)脈和頸總動(dòng)脈，不進(jìn)椎動(dòng)脈凝閉和夾閉。1 月后大鼠死亡12 只，存活18 只，其中假手術(shù)組10 只，模型組8 只。2 月后大鼠死亡15 只，存活15 只，其中假手術(shù)組9 只，模型組6 只。

1.2.3 學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)定 分別于造模后1月、2 月，用Morris 水迷宮檢測(cè)模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，方法同1.2.1。

1.2.4 組織樣本的制備 水迷宮測(cè)試結(jié)束后進(jìn)行取材。將大鼠脫頸處死，冰盤上快速剖取全腦，棄去嗅球及小腦，取海馬組織，用冰生理鹽水沖洗血液，再用濾紙拭干，電子天平稱重后迅速投入1.5ml的EPP 管中，加入9 倍冷生理鹽水，在玻璃勻漿器中研磨成10% 勻漿，低溫高速離心機(jī)上4℃、12000r/min 離心5min，提取上清液，－80℃凍存待檢。以10%水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔注射麻醉后，立即股動(dòng)脈取2ml 血液于肝素抗凝管中，再將抗凝管中血液迅速離心分離出血漿，－80℃凍存待檢。

1.2.5 tNOS、iNOS 活性和一氧化氮(NO)含量的測(cè)定 取出血漿，用NOS 和NO 測(cè)定試劑盒對(duì)其進(jìn)行測(cè)定。于550nm 測(cè)定NO 含量;530nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，根據(jù)吸光度大小可計(jì)算NOS 活力。根據(jù)cNOS 依賴鈣而iNOS 不依賴鈣進(jìn)行分型。具體步驟參照試劑盒說明操作。

1.2.6 海馬NOS 蛋白水平 取海馬組織，加入冰預(yù)冷的RIPA 裂解液(PMSF 和裂解液比例為1∶100)用電動(dòng)勻漿器于冰上制成10%的腦組織勻漿。并置于冰上1h［8］，使腦組織細(xì)胞充分溶解。12000r/min 4℃離心25min，小心吸取上清液至1.5 ml 的EPP 管中，BCA 法蛋白定量測(cè)試盒對(duì)上清液進(jìn)行蛋白定量，操作按照蛋白定量試劑盒說明書進(jìn)行。取10%海馬組織勻漿進(jìn)行Western blotting 檢測(cè)NOS 和β-actin 蛋白表達(dá)。

1.2.7 結(jié)果分析 Western blotting 結(jié)果用GDS-8000 型UVP 凝膠成像系統(tǒng)照相，以Labworks軟件分析結(jié)果，以β-actin 蛋白條帶作為內(nèi)參照，以NOS 蛋白條帶與β-actin 蛋白條帶像素灰度的百分比值作為NOS 蛋白質(zhì)表達(dá)的相對(duì)水平。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析或非參數(shù)檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)結(jié)果 模型1 月組大鼠平均逃避潛伏期明顯長(zhǎng)于對(duì)照組(P＜0.05)，表明VaD 大鼠定向航行能力降低，第5 天，觀察空間探索時(shí)移走平臺(tái)，以在原平臺(tái)象限(第1 象限)的活動(dòng)時(shí)間為指標(biāo)，與對(duì)照組比較，模型組第1 次穿越平臺(tái)所用時(shí)間延長(zhǎng)(P＜0.05)，穿越站臺(tái)次數(shù)明顯減少(P＜0.05)。表明VaD 大鼠學(xué)習(xí)能力降低。1 月組和2月組之間無統(tǒng)計(jì)差異(P＞0.05)(見表1)。

2.2 血漿NO 和海馬組織NO 表達(dá)含量 與假手術(shù)相比較，1 月和2 月模型組大鼠血漿和海馬組織中的NO 含量明顯增高(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與模型組中NOS 活性高于假手術(shù)組的結(jié)果相符。對(duì)比1 月組和2 月組NO 情況可見，1 月組NO 的含量明顯多于2 月組，差異明顯(P＜0.05)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表2)。

2.3 血漿和海馬組織tNOS 和iNOS 酶活性對(duì)1 月組和2 月組進(jìn)行血漿及海馬組織tNOS 和iNOS 酶活性的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比較，模型組大鼠血漿和海馬組織中tNOS 和iNOS 酶活性明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。1 月模型組和假手術(shù)組血漿及海馬組織tNOS 和iNOS 活性和2 月組分別進(jìn)行對(duì)比，顯示1 月組tNOS 和iNOS 活性高于2 月組，差異明顯(P＜0.01)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表3)。

2.4 模型組和對(duì)照組海馬NOS 蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相比較 模型組海馬組織NOS 蛋白表達(dá)水平明顯偏高(P＜0.05)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。1 月組海馬NOS 蛋白表達(dá)高于2 月組(P＜0.05)(見圖1)。

表1 VAD 組及假手術(shù)組大鼠定向航行實(shí)驗(yàn)及空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較(±s)

表1 VAD 組及假手術(shù)組大鼠定向航行實(shí)驗(yàn)及空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較(±s)

與假手術(shù)組比較* P＜0.05

表2 血漿和海馬組織NO 表達(dá)情況(血漿NO 單位:μmol/L;海馬組織NO 單位:μmol/g prot)

表3 1 月組和2 月組血漿及海馬組織tNOS 和iNOS 酶活性(血漿 單位:U/ml;海馬單位:U/mg prot)

圖1 NOS 蛋白表達(dá)水平

3 討論

VaD 是老年癡呆最常見病因之一，而關(guān)于VaD的發(fā)病機(jī)制有多種學(xué)說。鈣超載被認(rèn)為是VaD 發(fā)病機(jī)制中的一個(gè)重要致病因素，但是鈣超載在VaD 記憶和認(rèn)知功能低下中的機(jī)制尚未闡明。近年來，一氧化氮在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的病理生理作用成為神經(jīng)科學(xué)的研究熱點(diǎn)之一，有研究發(fā)現(xiàn)一氧化氮可參與突觸可塑性、神經(jīng)元興奮毒性及炎癥損害等多種過程，且與學(xué)習(xí)和記憶密切相關(guān)。VaD 發(fā)病時(shí)興奮性氨基酸釋放增多，激活N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)受體，使海馬神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度超載，NOS被大量激活并產(chǎn)生過量NO，過量的NO 不僅參與了腦損害，且在癡呆發(fā)病機(jī)制中可能有重要的作用［9］。

NO 性質(zhì)活潑，半衰期極短，在體內(nèi)生物半衰期僅數(shù)秒鐘，是一種正常生理狀態(tài)下存在的信息分子，在維持神經(jīng)元功能等方面有著重要作用。最近研究更表明，NO 在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)既有潛在的腦保護(hù)作用又有神經(jīng)毒性的危害作用，猶如一把雙刃劍［10］。NO的作用與NOS 水平密切相關(guān)［11］，對(duì)NOS 蛋白表達(dá)變化的研究是對(duì)NO 進(jìn)行深入探討的重要環(huán)節(jié)。NOS 主要有2 種類型，結(jié)構(gòu)型(cNOS)和誘導(dǎo)型(iNOS)，它們執(zhí)行不同的生理和病理功能，cNOS 是生理存在形式，依賴Ca2+或鈣調(diào)蛋白，作用快速短暫，生成NO 少;iNO 在腦缺血狀態(tài)下過度表達(dá)，作用時(shí)間長(zhǎng)，NO 生成量多［12］。腦缺血發(fā)生后，NOS 短暫急劇升高，此時(shí)的NOS 主要來源于cNOS。cNOS 平時(shí)以非活性形式存在，并受Ca2+/CaM 調(diào)節(jié)，cNOS 的大量激活引起NO 的升高。但隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，腦組織中O2和L-精氨酸供給減少，NOS 活性會(huì)逐漸下降。而由iNOS 介導(dǎo)引起的神經(jīng)毒性作用，主要參與VaD 引起的缺血晚期腦損傷。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，可使iNOS 激活，而iNOS 一旦生成就會(huì)持續(xù)產(chǎn)生NO而不受胞內(nèi)Ca2+濃度的影響，過量的iNOS 產(chǎn)生大量具有神經(jīng)毒性作用的NO，在海馬遲發(fā)型神經(jīng)元凋亡和癡呆形成中均發(fā)揮了一定的作用。NO 作為細(xì)胞內(nèi)信使參與長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)的誘導(dǎo)和形成，NOS與NO 可影響學(xué)習(xí)記憶等過程，iNOS 被認(rèn)為是影響學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵酶［13］。

本研究不僅對(duì)血管性癡呆大鼠血漿及腦組織內(nèi)NOS 活性和一氧化氮進(jìn)行了研究，還對(duì)比分析了癡呆大鼠缺血后1 月和2 月血漿和海馬組織內(nèi)NOS、NO 的活性含量，探索了NOS 以及NO 在癡呆發(fā)病中的一個(gè)動(dòng)態(tài)變化情況。結(jié)果顯示，經(jīng)4-VO 造模后，血管性癡呆模型大鼠平均逃避潛伏期明顯長(zhǎng)于假手術(shù)組，撤去平臺(tái)后，模型組第1 次穿越平臺(tái)所用時(shí)間延長(zhǎng)，穿越站臺(tái)次數(shù)明顯減少，表明VaD 大鼠模型構(gòu)建良好，但是1 月組和2 月組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型1 月組和2 月組血漿和海馬組織NOS 酶活性及NO 含量顯著高于假手術(shù)組，并且與行為學(xué)上的變化相一致。大鼠缺血2 月后血漿和海馬組織iNOS 的活性仍然比較高，推測(cè)隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，NOS 主要來源于iNOS。iNOS 活性持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，可引起長(zhǎng)時(shí)間的NO 的晚期釋放。通過對(duì)比1 月組和2 月組血漿和海馬組織NOS 和NO 含量發(fā)現(xiàn)，1月組血漿和海馬組織NOS 活性和NO 含量均高于2月組，表現(xiàn)為隨著病程的延長(zhǎng)，2 月組的NOS 活性和NO 含量趨于下降，這一方面可能與前期釋放的cNOS 活性的下降導(dǎo)致tNOS 的總活性減弱有關(guān)，另外也可能與自身缺血疾病的緩慢緩解和改善有關(guān)。

綜上所述，NOS 活性和NO 含量可能與腦缺血后引起的神經(jīng)損傷密切相關(guān)，可能在血管性癡呆疾病形成過程中發(fā)揮了重要的作用。

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