葉青華

（成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院，四川 成都 611130）

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)用兔 成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院實(shí)訓(xùn)場(chǎng)飼養(yǎng)的未經(jīng)兔出血癥疫苗免疫的商品兔，體重2～2.5kg。

1.2 種毒 RHDV地方毒株。采取兔出血癥病死兔的肝、脾組織，去除周圍的筋膜，在滅菌生理鹽水中清洗數(shù)次，加適量PBS液，于組織勻漿機(jī)中完全搗碎，然后按1∶5比例加入滅菌PBS液，經(jīng)37℃～-80℃反復(fù)凍融3次。1500r/min離心10min，取上清液，再加入1000IU/mL的青、鏈霉素，37℃感作2h。將上述處理好的病料，感染未經(jīng)免疫的敏感兔，使其發(fā)病。取發(fā)病兔的肝組織加滅菌PBS液搗碎，1500r/min離心10min，取上清液，HA滴度在1∶1280以上即可備用。

1.3 佐劑 蜂膠，氫氧化鋁膠。

1.4 兔出血癥不同佐劑滅活苗的制備

1.4.1 兔出血癥組織滅活苗的制備 無(wú)菌采取人工感染發(fā)病后的兔肝、脾，按1∶10比例加入滅菌PBS液搗碎，1500r/min離心10min，在上清液中加入0.4%的甲醛，放在37℃搖床中滅活48h。

1.4.2 兔出血癥蜂膠佐劑滅活苗的制備 取市場(chǎng)上購(gòu)置的優(yōu)質(zhì)蜂膠搗成細(xì)末，按1∶4的比例加入95%的食用酒精，置23℃水浴24 h，其間不斷搖勻，取出冷至室溫，3 800 r/min離心30 min，取上清液即為蜂膠乙醇浸液。將1.4.1制備的兔出血癥組織滅活苗與蜂膠乙醇浸液按1∶3比例混合，勻漿，4℃下作用24 h即成蜂膠佐劑疫苗。

1.4.3 兔出血癥鋁膠佐劑滅活苗的制備 用去離子水將三氯化鋁配成8%的溶液，加溫至56～60℃；再用去離子水將氫氧化鈉配成4%的溶液，緩慢加入三氯化鋁溶液中，調(diào)節(jié)pH至5.6～6.0，再加溫10min，分裝瓶中，121℃高壓蒸汽滅菌30min，即成鋁膠佐劑。將1.4.1制備的兔出血癥組織滅活苗與鋁膠佐劑按1∶1比例混勻，即成鋁膠佐劑滅活苗。

1.4.4 疫苗檢驗(yàn) 按常規(guī)方法檢查其物理性狀，并進(jìn)行菌檢及安全性檢驗(yàn)。

1.5 免疫接種 選取未經(jīng)兔出血癥疫苗免疫的試驗(yàn)兔16只，隨機(jī)分成4組，每組4只，隔離飼養(yǎng)。1～3組分別于頸部皮下注射兔出血癥組織滅活苗、蜂膠佐劑苗、鋁膠佐劑苗1mL，第4組于頸部皮下注射滅菌生理鹽水1mL。接種后7、14、45、85、145d進(jìn)行耳靜脈采血，用微量法作血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)抗體效價(jià)。

1.6 攻毒保護(hù)試驗(yàn) 攻毒病料制備：將兔出血癥病料加入少量PBS液在組織搗碎機(jī)中充分磨碎，然后制成1∶5懸液，經(jīng)37℃～-80℃反復(fù)凍融3次。1500r/min離心10 min，取上清液,內(nèi)加1 000 IU/mL的青、鏈霉素，37℃感作2h即成。

試驗(yàn)兔全部攻毒。分別在疫苗接種后7、15、50、90、150d進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，每只肌注病料液1mL。

2 結(jié)果

2.1 抗體檢測(cè) 4組試驗(yàn)兔全部進(jìn)行抗體檢測(cè)，其結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 攻毒保護(hù)試驗(yàn) 非免疫對(duì)照組試驗(yàn)兔48h內(nèi)全部死亡，剖檢均呈現(xiàn)出典型的兔出血癥癥狀。免疫組攻毒結(jié)果詳見(jiàn)表2。

表1 免疫兔血清抗體檢測(cè)結(jié)果

表2 攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果

3 小結(jié)與討論

3.1 3種疫苗均于免疫后7d產(chǎn)生抗體，此時(shí)，蜂膠佐劑苗的抗體滴度最高，鋁膠佐劑苗的抗體滴度最低。14d后，佐劑苗的抗體滴度均高于組織滅活苗的抗體滴度，其中以蜂膠佐劑苗的抗體滴度最高。45d后抗體滴度均有所下降，但以蜂膠佐劑苗的抗體滴度下降最慢。據(jù)報(bào)道，蜂膠佐劑苗在免疫30d后抗體滴度高達(dá)211，幾乎是組織滅活苗抗體滴度的2倍，且還有上升趨勢(shì)。表明蜂膠佐劑滅活苗的抗體滴度高于其他2種疫苗，這與蜂膠既能促進(jìn)機(jī)體對(duì)抗原產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)，又能啟動(dòng)機(jī)體非特異性免疫反應(yīng)有關(guān)。由此可見(jiàn)，蜂膠佐劑滅活苗吸收快，產(chǎn)生效價(jià)高而持久，是值得推廣的新型疫苗。組織滅活苗中的抗原成分在短時(shí)間內(nèi)即能被組織大量吸收，產(chǎn)生較高水平的抗體。鋁膠佐劑滅活苗由于抗原成分釋放緩慢，產(chǎn)生高水平抗體所需的時(shí)間較長(zhǎng)。

3.2 從攻毒保護(hù)試驗(yàn)來(lái)看，3種疫苗均能有效抵抗兔出血癥強(qiáng)毒的攻擊。免疫后7d，鋁膠佐劑滅活苗的抗體滴度最低，為26.5，但攻毒后試驗(yàn)兔均能成活，而非免疫對(duì)照組全部死亡，說(shuō)明26.5抗體滴度已能有效抵抗兔出血癥強(qiáng)毒的攻擊。免疫后150d攻毒，免疫組試驗(yàn)兔雖有不同程度的死亡，但以組織滅活苗組的死亡率最高，達(dá)75%，蜂膠佐劑滅活苗組死亡率最低，達(dá)25%。表明組織滅活苗的免疫期較佐劑疫苗短，而蜂膠佐劑滅活苗的免疫期較長(zhǎng)。據(jù)報(bào)道，兔出血癥滅活苗的免疫期為4～6個(gè)月，合理攻毒試驗(yàn)應(yīng)在免疫后10d內(nèi)或4個(gè)月后，這樣才能更好地看出不同佐劑疫苗在保護(hù)率方面的差異。

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