吳小娟，李宏喜，張婷婷，單有全

（1.甘肅省清水縣畜牧獸醫(yī)局，甘肅 清水 741400；2.甘肅省清水縣紅堡鎮(zhèn)動物疫病防控與畜牧技術(shù)服務(wù)中心，甘肅 清水 741400；3.甘肅省清水縣黃門鄉(xiāng)動物疫病防控與畜牧技術(shù)服務(wù)中心，甘肅 清水 741400）

2013年清水縣?？谔阋呖贵w水平的檢測與分析

吳小娟1，李宏喜1，張婷婷2，單有全＊3

（1.甘肅省清水縣畜牧獸醫(yī)局，甘肅 清水 741400；2.甘肅省清水縣紅堡鎮(zhèn)動物疫病防控與畜牧技術(shù)服務(wù)中心，甘肅 清水 741400；3.甘肅省清水縣黃門鄉(xiāng)動物疫病防控與畜牧技術(shù)服務(wù)中心，甘肅 清水 741400）

口蹄疫（foot and mouth disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起，多種偶蹄動物共患的一種急性、熱性、高度傳染性疫病?？谔阋卟《揪哂卸嘈托浴⒁鬃冃缘奶攸c。根據(jù)其血清學(xué)特征，現(xiàn)已知有7個血清型即A、O、C、南非1、南非2、南非3及亞洲Ⅰ型［1］其病理特征是患病動物口腔黏膜以及蹄部和乳房皮膚等處發(fā)生水泡和潰爛。本病被世界衛(wèi)生組織（WHO）列為A類動物疫病之首，被我國農(nóng)業(yè)部列為一類疫病。是我國重點防御的疾病。

近幾年，口蹄疫病毒造成的危害時有發(fā)生，已造成了相當(dāng)大的經(jīng)濟損失并直接威脅到人類生命及公共衛(wèi)生安全。免疫疫苗是我國采取的主要措施之一。為了防控重大動物疫病的發(fā)生和傳播，全國各地相繼進行?？谔阋咭呙缑庖呓臃N工作。同時，通過實驗室檢測手段掌握疫苗免疫后畜體內(nèi)產(chǎn)生的抗體水平是否具有保護作用，并對免疫失敗個體進行補免，最大程度提高疫苗免疫保護作用，確保牲畜健康生產(chǎn)。在本地區(qū)抽取885份被免牛的血清進行抗體檢測，以便了解抗體水平變化規(guī)律。并將獲得的血清學(xué)檢測資料進行分析。結(jié)果通報如下。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 主要儀器 96孔110°反應(yīng)板、微量移液器、震蕩器、H－25型離心機、DK－8AD型定熱恒溫水槽。

1.1.2 血清 實驗采用血清來自清水縣13鄉(xiāng)鎮(zhèn)，實驗份數(shù)為885份，血液采集時間一般在接種后20 d左右。

1.1.3 試劑 口蹄疫O型免疫抗體正向間接血凝診斷試劑，口蹄疫O型正向血凝抗原，陰性血清，口蹄疫O型陽性血清，稀釋液。（生產(chǎn)廠家：中國農(nóng)科院蘭州獸醫(yī)研究所）。

1.2 試驗方法

1.2.1 抗原標(biāo)定 操作方法：以《2008動物防疫新技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程與管理法規(guī)手冊》為依據(jù)進行抗原標(biāo)定［2］。

1）用微量移液器向V型微量反應(yīng)板（110°）每孔分別加間接血凝診斷試劑25μL。

2）換一吸頭吸取25μL抗原液，加于第1孔的間接血凝診斷試劑中，并用移液器擠壓15～20次使液體混和均勻，然后取25μL移入第2孔，混勻后取25μL移入第3孔，依次倍比稀釋到第11孔，第11孔中液體混勻后從中吸出25μL棄去。第12孔不加抗原，作對照（詳見表1）。

3）換一吸頭吸取1%紅細(xì)胞懸液依次加入1～12個孔中，每孔加25μL。

4）加樣完畢，將反應(yīng)板置于微型振蕩器上振蕩1～2min，室溫（18～20℃）下作用45min，觀察結(jié)果。

結(jié)果判定：參照黃創(chuàng)科等［3］的判斷方法，觀察反應(yīng)混合液，根據(jù)出現(xiàn)凝集的程度：紅細(xì)胞平鋪孔底，呈倒?fàn)畹膫銧睿吘売芯砥鸬内呄?，特別顯著者判為：＋＋＋＋（100%）；次之：＋＋＋（75%）；凝集清楚可見：＋＋（50%），再次之（25%）；陰性是血球沉于孔底中心，呈紐扣狀。將板傾斜，觀察紅細(xì)胞有無凝集，及其凝集狀態(tài)。血凝達50%以上的抗原最高稀釋倍數(shù)代表一個血凝單位［4］。

（注：該標(biāo)準(zhǔn)是以畜流感抗體間接血凝試驗抗體效價≥25判為合格為依據(jù)的［4］）

1.2.2 間接血凝（HI）試驗 以《口蹄疫防治技術(shù)規(guī)范》［5］為依據(jù)進行間接血凝（HI）試驗。

制備4個血凝單位的抗原液：根據(jù)HA試驗結(jié)果，確定抗原的血凝價，用間接血凝診斷試劑液稀釋，使之含4個血凝單位的抗原。稀釋倍數(shù)按下式計算：

表1 抗原標(biāo)定試驗操作術(shù)式

操作方法：①用微量移液器加間接血凝診斷試劑，1～11孔各加25μL，第12孔加50μL；②換一吸頭取待檢血清25μL置于第1孔的間接血凝診斷試劑中，擠壓15～20次混勻，吸出25μL放入第2孔中，然后依次倍比稀釋至第10孔，并將第10孔的液體混勻后取25μL棄去。第11孔加入25μL口蹄疫H5HI血清做對照，第12孔為間接血凝診斷試劑對照（詳見表2）；③用微量移液器吸取稀釋好的4個血凝單位的抗原液，向1～11孔中分別加25μL。然后，振蕩1～2min，室溫（18～20℃）下放置30min；④取出血凝板，用微量移液器向每一孔中各加入1%紅細(xì)胞懸液25μL，再將反應(yīng)板置于微型振蕩器上振蕩1～2min，混和均勻；⑤將反應(yīng)板置室溫（18～20℃）下作用40min，觀察結(jié)果。

表2 間接血凝試驗操作術(shù)式

1.3 結(jié)果判定

陰性對照血清1∶32孔、稀釋液對照孔均應(yīng)無凝集，陽性血清1∶2～256各孔應(yīng)出現(xiàn)“＋＋至＋＋＋＋”凝集為合格［5］。

在對照孔合格的前提下，再觀察待檢血清各孔以呈現(xiàn)“＋＋”凝集的最大稀釋倍數(shù)為該份血清的抗體效價，以完全抑制4個HAU抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為HI滴度。只有陰性對照孔血清滴度不大于23，陽性對照孔血清誤差不超過1個滴度，試驗結(jié)果才有效。HI價小于或等于24判定HI試驗陰性。

以H5的間接血凝（HI）效價達到25及以上為合格［6］。接種口蹄疫疫苗的免疫抗體效價達到1∶32為免疫合格［6］，有抗口蹄疫病毒感染的能力，低于1∶32時應(yīng)接種疫苗。70%血凝集為該份血清的最高抗體效價判為合格。

根據(jù)農(nóng)業(yè)部《2008年高致病性禽流感和口蹄疫等重大動物疫病免疫方案》的相關(guān)規(guī)定，口蹄疫免疫21d抗體效價≥32（25）且合格率必須≥70%為免疫合格［7］。

2 結(jié)果

2.1 間接血凝試驗結(jié)果

清水縣13個鄉(xiāng)鎮(zhèn)牛口蹄疫抗體的血清學(xué)檢測結(jié)果如表3所示。在檢測的陽性結(jié)果中，清水縣?？谔阋逴型最高抗體滴度為256（28），主要分布在紅堡鎮(zhèn)、永清鎮(zhèn)2個鄉(xiāng)鎮(zhèn)；HI最低抗體滴度為8（23），主要分布在遠(yuǎn)門鄉(xiāng)、新城鄉(xiāng)2個鄉(xiāng)鎮(zhèn)。清水縣總體血清抗體陽性率為79.38%，血清抗體陽性率以永清鎮(zhèn)和紅堡鎮(zhèn)最高，達89.61%和88.64%，血清抗體陽性率以遠(yuǎn)門鄉(xiāng)最低，為68.75%；永清鎮(zhèn)、白沙鄉(xiāng)等11個鄉(xiāng)鎮(zhèn)?？谔阋逴型疫苗的免疫合格，遠(yuǎn)門鄉(xiāng)1個鄉(xiāng)鎮(zhèn)未達到標(biāo)準(zhǔn)，其余各鄉(xiāng)鎮(zhèn)抗體水平均處于70%～90%之間。其中，六個鄉(xiāng)鎮(zhèn)在70%～80%之間，五個鄉(xiāng)鎮(zhèn)在80%～90%之間。從分布來看，偏僻地方的口蹄疫抗體效價普遍偏低，應(yīng)加強免疫。

表3 2013年清水縣13鄉(xiāng)鎮(zhèn)口蹄疫抗體血清學(xué)檢測結(jié)果

3 分析與討論

3.1 抗體效價

從總體監(jiān)測結(jié)果來看，清水縣的口蹄疫免疫抗體效價水平總體水平較高，保持在70%～80%左右，基本達到農(nóng)業(yè)部《2008年高致病性畜流感和口蹄疫等主要動物疫病監(jiān)測方案》中規(guī)定的口蹄疫抗體效價以大于等于32為合格，且合格率大于等于70%的總體要求［8］。說明清水縣家畜口蹄疫強制免疫密度大，效果較好。2013年以來，雖然本地家畜飼養(yǎng)量大、交易頻繁，但未發(fā)生一例口蹄疫疫情，更說明了免疫工作對于預(yù)防口蹄疫疫情的極端重要性。

雖然清水縣的口蹄疫免疫抗體效價水平總體水平較高，但是還有部分鄉(xiāng)鎮(zhèn)免疫率較低，究其原因，有以下幾種可能①打飛針，注射淺。疫苗的注射部位不準(zhǔn)確、劑量不足。抽針時也存在疫苗回流耗損現(xiàn)象，導(dǎo)致有效注射劑量不足；②免疫密度未達到要求。病畜、瘦弱畜、臨產(chǎn)畜、幼畜等不能注射疫苗，而此次防疫在2月底3月初進行，部分牲畜處于臨產(chǎn)期而未注射疫苗；③疫苗保存及運輸要求在2～8℃環(huán)境下，避光保存，使用過程中未完全按照要求操作，影響了疫苗質(zhì)量；④口蹄疫疫苗放置時間過長，容易出現(xiàn)沉淀，在使用前應(yīng)搖勻。疫苗注射14～21 d后動物機體產(chǎn)生免疫抗體，在未產(chǎn)生抗體或抗體才開始產(chǎn)生水平不高時采集血清會影響到抗體效價；⑤各種應(yīng)激，如藥物干擾、疾病感染以及抗原間相互反作用等都可能影響機體免疫球蛋白的產(chǎn)生；⑥一針多用在注射時不換針頭，個針頭注射多頭牛。如果遇到帶毒?；蛴袀魅静〉呐＃瑫魅酒渌呐?，所以注射頭牛后要換個針頭；⑦家畜自身的原因，個別牛在注苗后沒有產(chǎn)生免疫力。另外，抗體變化中的反彈現(xiàn)象對抗體上升與下降規(guī)律的影響，在指導(dǎo)監(jiān)測的時間及對監(jiān)測結(jié)果的分析過程中，也會引起效價波動［9］。

4 預(yù)防

口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的偶蹄動物一種急性、烈性、高度接觸性傳染病，對人類也有一定的感染性?？谔阋叩牧餍薪o世界畜牧業(yè)造成極大危害和巨大經(jīng)濟損失，同時也成為影響人類公眾衛(wèi)生健康的重要源頭之一，口蹄疫的危害在于其傳播途徑多，傳染性強，近年來，在我國相繼發(fā)生流行，嚴(yán)重影響了畜牧業(yè)的發(fā)展和動物及動物產(chǎn)品的國際貿(mào)易。國際獸醫(yī)局（OIE）將其列為A類傳染病首位，我國也將其列一類傳染病。為了盡快撲滅此病，國家對口蹄疫實行強制免疫 。

做好口蹄疫的預(yù)防工作，不僅對促進清水地區(qū)畜牧業(yè)的發(fā)展，而且對搞好全縣公共衛(wèi)生事業(yè)都具有重要意義，不可忽視。方法有：①一般措施：加強飼養(yǎng)管理，保持畜舍衛(wèi)生，經(jīng)常進行消毒，對購進動物及產(chǎn)品、飼料、生物制品等進行嚴(yán)格檢疫，平時減少機體應(yīng)激反應(yīng)；②預(yù)防接種：適時對健康畜進行注射口蹄疫滅苗。每頭牛肌肉注射5mL，必要時加量注射。注射半個月后產(chǎn)生免疫力。每年免疫2～4次，同型保護一年；③消毒：糞便進行堆積發(fā)酵處理或用5%氨水消毒，畜舍、場地和用具以2%～4%燒堿液、10%石灰乳、0.2%～0.5%過氧乙酸或1%～2%福爾馬林噴灑消毒，毛、皮張用環(huán)氧乙烷、溴甲烷或甲醛消毒，肉品以2%乳酸或自然熟化處理。

［1］孫振云，金 珊.正向間接血凝試驗在檢測口蹄疫抗體中的應(yīng)用［J］.畜牧與飼料科學(xué)，2007，（02）：70.

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［3］黃創(chuàng)科，托建東，駱志強，等.口蹄疫免疫抗體效價的測定及結(jié)果分析［J］.農(nóng)村科技，2007，（7）：69.

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［5］陳 九.高致病性禽流感防治技術(shù)規(guī)范等8項國家標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布實施［J］.中國標(biāo)準(zhǔn)化，2004，（3）：77.

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［8］謝海燕，賴笑嫻，朱燕秋，等.口蹄疫間接血凝試驗與ELISA試驗結(jié)果的相關(guān)性探討［J］.中國獸醫(yī)雜志，2008，（6）：30－31.

［9］劉 穎，冉多良，馬 揚，等.正向間接血凝試驗監(jiān)測家畜O型口蹄疫抗體［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2007，（19）：49－51.

S823.2

A

1001－9111（2013）06－0084－03

2013－08－14

2013－10－26

吳小娟（1972－），女，甘肅省清水縣人，助理畜牧師，主要從事畜牧技術(shù)推廣工作。

＊通訊作者：單有全（1976－），男，甘肅清水縣人，獸醫(yī)師，主要從事動物疫病防控與畜牧技術(shù)工作。