陳仁金，王珍珍，楊章平，毛永江，冀德君，朱孝榮

（1.徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，江蘇 徐州 212004；2.徐州醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)研究中心，江蘇 徐州 212004；3.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)科學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 22500）

乳房炎是奶牛最常見的疾病之一，在世界范圍內(nèi)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，研究者嘗試許多方法用于控制這種復(fù)雜的疾病，包括改進(jìn)牧場的管理、對干奶牛進(jìn)行抗生素治療、注射疫苗和監(jiān)控臨床乳房炎等。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，用生物技術(shù)手段來預(yù)防和控制乳房炎成為熱點(diǎn)之一。

IL－8自發(fā)現(xiàn)以來，成為在趨化性細(xì)胞因子中是一個(gè)比較活躍的研究領(lǐng)域，各種非特異性炎癥的病理發(fā)生過程中頻繁地有IL－8的參與，以及IL8基因易于受到外界的刺激而被激活，因此IL－8可能在炎癥、免疫反應(yīng)和機(jī)體防御反應(yīng)中具有廣泛的作用。對于IL－8在人類上研究較多［1－3］，而與奶牛疾病方面的研究最近幾年越來越受關(guān)注。IL－8易于受到外界的刺激而被激活，已研究證明IL－8蛋白和mRNA的表達(dá)與奶牛乳房炎有密切的聯(lián)系［4］。當(dāng)牛乳房受感染后，IL－8能誘導(dǎo)宿主防御系統(tǒng)抵抗病菌的侵入，同時(shí)IL－8會(huì)大量聚集。IL8基因的表達(dá)量也顯著增加［5－7］。研究發(fā)現(xiàn)IL8基因－233（G＞A）和2789（A＞G）＆2862（T＞C）位點(diǎn)對SCS顯著相關(guān)；了探索該位點(diǎn)不同基因型個(gè)體在血液中的表達(dá)差異，對該位點(diǎn)形成的不同基因型個(gè)體熒光定量PCR分析。對IL8基因的抗病機(jī)理進(jìn)行初步探索，為奶牛抗乳房炎性狀候選基因的研究積累基礎(chǔ)分子數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取揚(yáng)大牧場健康的中國荷斯坦牛30頭。胎次在2～3胎，處于泌乳中期。保證IL8基因各個(gè)基因型10頭。尾靜脈采血，ACD抗凝劑，新鮮血樣提取RNA，提取的RNA－70℃保存。

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)用于熒光定量的目的基因IL8基因的mRNA序列（GenBank：NM＿173925）設(shè)計(jì)引物，內(nèi)參基因β－actin引物根據(jù) mRNA序列（GenBank：AY141970）設(shè)計(jì)。引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物見表1。

表1 熒光定量PCR引物

1.3 RT－PCR

反應(yīng)過程參照TaKaRa RNA AL PCRTMKit（AMV）反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明，按步驟進(jìn)行。將血液中總RNA作為模板在滅菌的0.2mL PCR離心管中依次加入以下組分的樣品。反轉(zhuǎn)錄體系為20 μL（反應(yīng)液在冰上配制）：在0.2mL的PCR管中加入1μg的總RNA，Oligo dT Primer 1μL，5×PrimeScriptTMBuffer 4μL，Random primers 1μL，PrimeScriptTMRT Enzyme Mix I 1μL，加 RNase Free dH2O至總體積為20μL。將加好試劑的PCR管瞬時(shí)離心后放在PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。反轉(zhuǎn)錄條件如下：37℃15min（反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)）85℃5sec（反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)）所得產(chǎn)物即為cDNA，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

采用SYBR GreenⅠ染料法進(jìn)行熒光定量，熒光定量PCR體系為20μL：

以上步驟均為冰上操作，每個(gè)樣本設(shè)三個(gè)重復(fù)。

熒光定量PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性1min；95℃變性30s，60℃退火15s，72℃延伸34s（data collection），40個(gè)循環(huán)；為分析擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，PCR擴(kuò)增結(jié)束后采集多個(gè)信息點(diǎn)進(jìn)行溶解曲線分析，程序?yàn)椋?5℃ 15s，60 ℃ 1min；95 ℃ 15s，60℃15s。

1.5 統(tǒng)計(jì)軟件與方法

Primer Premier 5.0，SPSS11.0統(tǒng)計(jì)分析軟件熒光定量計(jì)算采用2－△△CT方法［8］。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA的提取

RNA提取結(jié)果見圖1總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢出3條亮帶，從上到下分別為28s，18s和5s，說明提取的RNA完整性良好，無明顯降解，其OD260／OD280在1.8左右，純度較高，可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.2 IL8基因突變位點(diǎn)3種基因的相對定量表達(dá)分析

IL8基因－233（G＞A）位點(diǎn)的突變產(chǎn)生3種基因型。AA、AG和GG 3種基因型在血液中的熒光定量的△CT見表2，GG基因型的△CT極顯著低于AA和AG基因型（P＜0.01）。GG基因型的相對表達(dá)量極顯著高于AA和AG基因型（P＜0.05）（圖2）。

圖2 IL8基因－233（G＞A）位點(diǎn)不同基因型的表達(dá)量

表2 IL8基因－233（G＞A）位點(diǎn)不同基因型個(gè)體的△CT和RQ值

3 討論

IL8是一種重要的趨化因子，具有刺激中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞發(fā)生趨化游走，介導(dǎo)細(xì)胞在炎癥部位聚集、活化以及修復(fù)損傷的組織等功能［9］。然而，這些作用必須通過其與相應(yīng)受體（interleukin－8receptor，IL8R，即CXCR）結(jié)合并借助信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來實(shí)現(xiàn)［10］。在大腸桿菌感染引起的乳房炎的奶中，IL－8含量顯著增加［11，12］。在金黃色葡萄球菌感染的奶牛乳房炎泌乳物中，能檢測到IL－8趨化活性，但在非乳房炎泌乳物中沒有此活性［13］。所以在乳房炎發(fā)生時(shí)，IL－8誘導(dǎo)激發(fā)中性粒細(xì)胞時(shí)起著重要的作用。

對于IL8基因的－233（G＞A）位點(diǎn)，GG基因型的表達(dá)量顯著高于其它兩種基因型（P＜0.05），所以GG基因型有較強(qiáng)的乳房炎抗性。233（G＞A）位點(diǎn)位于IL8基因的5′側(cè)翼區(qū)，該突變可能影響該基因表達(dá)調(diào)控，結(jié)果顯示，突變使該基因的表達(dá)量下降。對于其機(jī)理，需要進(jìn)一步進(jìn)行分析研究。

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