關(guān) 鑫，王宇歆，涂正偉，李東華，吳 騰，鹿燕敏，張 一，劉洪斌

基于四級桿飛行時間質(zhì)譜技術(shù)的大鼠急性胰腺炎尿液代謝組學(xué)

關(guān) 鑫，王宇歆，涂正偉，李東華，吳 騰，鹿燕敏，張 一，劉洪斌

目的：應(yīng)用四級桿飛行時間質(zhì)譜的代謝組學(xué)技術(shù)，對大鼠在急性胰腺炎（AP）時尿液的變化特征及生物標(biāo)記物進(jìn)行分析。方法：將12只雄性大鼠平均分為模型組和對照組，采用由膽胰管逆行注射?；悄懰徕c誘發(fā)的AP模型，造模后分置于代謝籠飼養(yǎng)，收集24 h尿液；運用高效液相色譜串聯(lián)電噴霧四級桿飛行時間質(zhì)譜（LC-ESI-Q-TOF-MS）技術(shù)，分別采用正譜與負(fù)譜模式掃描處理后的尿液樣本，結(jié)合主成分分析（PCA）和偏最小二乘判別分析法（PLS-DA）研究兩組尿液間主要代謝物質(zhì)的差異。結(jié)果：兩組大鼠尿液代謝輪廓圖在正譜與負(fù)譜模式下均得到了良好的區(qū)分，發(fā)現(xiàn)了18個潛在的生物標(biāo)志物。結(jié)論：基于四級桿飛行時間質(zhì)譜技術(shù)的代謝組學(xué)研究方法分析尿液中的代謝物特征，可以將AP模型與對照組大鼠進(jìn)行區(qū)分，是發(fā)現(xiàn)未知生物標(biāo)志物的有效手段。

急性胰腺炎；尿液代謝組學(xué)；液質(zhì)聯(lián)用；大鼠；生物標(biāo)志物

急性胰腺炎（acute pancreatitis,AP）是由于胰酶消化了胰腺及其周圍組織所引起的急性炎癥[1]。目前有關(guān)AP的研究主要集中在發(fā)病機(jī)制[2]以及疾病相關(guān)的治療評價[3-4]方面，關(guān)于胰腺炎的診斷標(biāo)志物的研究也有相關(guān)報道[5-6]，但僅僅針對單一指標(biāo)的研究，對于AP引起的全身性代謝變化涉及較少。本文應(yīng)用高精密度、高靈敏度的液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的代謝組學(xué)方法分析大鼠AP模型組與對照組的尿液樣本，從整體代謝角度探討AP時大鼠體內(nèi)代謝的特征，試圖發(fā)現(xiàn)反應(yīng)AP代謝特征的生物標(biāo)志物，為AP的臨床診斷和藥物療效評價提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 SPF級雄性Wistar大鼠12只，體質(zhì)量(250±10)g，由中國藥品生物制品檢定所動物中心提供。單籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑 ?；悄懰徕c、疊氮鈉購自Sigma公司；漢黃芩苷、鹽酸曲馬多購自中國藥品生物制品檢定所；甲醇購自Merck公司；水合氯醛，甲酸為分析純。

1.2.2 儀器 意大利Tecniplast公司LR25R10型大鼠代謝籠；DIONEX U3000高效液相色譜系統(tǒng)，包括：在線脫氣機(jī)，二元輸液泵，自動進(jìn)樣器，柱溫箱，紫外檢測器；色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C8（4.6×150 mm I.D.,5μm）。Barnstesd EASYpure II型超純水機(jī)。Bruker micrOTOF-QII飛行時間質(zhì)譜儀，配置電噴霧離子源，Hystar 3.2操作軟件及ProfileAnalysis數(shù)據(jù)處理軟件。

1.3 AP模型的建立 Wistar大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，實驗前禁食12 h，自由飲水。隨機(jī)分為實驗組(n=6)和對照組(n=6)。腹腔注射10%水合氯醛（0.3 g/kg）麻醉，仰臥固定，剃去胸骨劍突以下毛發(fā)。無菌條件下經(jīng)腹壁正中線切1 cm切口，暴露膽管初始端，以無損傷小動脈夾阻斷膽管，尋找膽胰管十二指腸乳頭開口處，在其相對的系膜邊緣用4號針頭刺一小孔，用PE50導(dǎo)管經(jīng)該乳頭部逆行插管入膽胰管0.5 cm，注入3%?；悄懰徕c生理鹽水溶液（1 mL/kg，0.1 mL/min）。對照組大鼠僅注射相同體積生理鹽水。注射完畢5 min后除去小動脈夾，縫合十二指腸穿刺孔，逐層關(guān)腹[7]。

1.4 樣品的采集與制備

1.4.1 溶液配制 稱取25.0 mg漢黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品，30.5 mg鹽酸曲馬多標(biāo)準(zhǔn)品，分別放入25 mL的容量瓶中，加入甲醇溶解，定容至刻度，配制成1 mg/mL的內(nèi)標(biāo)儲備液。分別取一定量的漢黃芩苷和鹽酸曲馬多儲備液，用甲醇-水（50∶50，v/v）稀釋至濃度為5μg/mL和1μg/mL，作為混合內(nèi)標(biāo)溶液。

1.4.2 樣品收集 造模大鼠置于代謝籠飼養(yǎng)，自由飲水，收集24 h尿液。樣品采集瓶中分別加入500μL疊氮鈉防腐，然后置于冰水中冷藏。24 h尿液經(jīng)離心后上清置于-20℃冰箱凍存。

1.4.3 樣品制備 尿液室溫解凍，吸取200μL加入1.5 mL EP管，再加入700μL甲醇，100μL甲醇-水（50∶50，v/v），渦旋混合30 s，4℃下12 000 rpm離心10 min。上清轉(zhuǎn)移至加有1 mL去離子水的EP管中，渦旋混合，進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用分析。

1.5 液質(zhì)聯(lián)用方法

1.5.1 液相色譜條件 Agilent Zorbax Eclipse XDBC8柱（4.6×150 mm I.D.，5μm粒徑）色譜柱，流動相A：水（0.1%FA），流動相B：甲醇；梯度洗脫程序：0～5 min：5%B，5～8 min：20%B，8～15 min：30%B，15～25 min：95%B，25～29 min：95%B，29～30 min：5%B，30～35 min：5%B；流速為0.3 mL/min，柱溫箱溫度設(shè)定為30℃，進(jìn)樣量20 mL。

1.5.2 飛行時間質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧離子化源，各項源參數(shù)及質(zhì)譜參數(shù)詳見表1。

表1 大鼠急性胰腺炎模型尿液代謝組學(xué)分析質(zhì)譜參數(shù)

1.5.3 精密度實驗 按照“樣品制備”方法，尿液室溫解凍，吸取200μL加入1.5 mL EP管，再加入700μL甲醇，100μL內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混合30 s。4℃下，12 000 rpm離心10 min。將上清轉(zhuǎn)移至加有1 mL去離子水的EP管中，渦旋混合，連續(xù)分析6針，正譜、負(fù)譜全掃描及內(nèi)標(biāo)色譜圖見圖1。

圖1 大鼠急性胰腺炎模型尿液代謝組學(xué)分析方法掃描圖

2 結(jié)果

2.1 精密度實驗 標(biāo)準(zhǔn)添加樣品分別經(jīng)過正、負(fù)譜連續(xù)進(jìn)樣分析，比較內(nèi)標(biāo)峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見表2。

表2 大鼠急性胰腺炎模型尿液代謝組學(xué)分析方法精密度

2.2 數(shù)據(jù)分析 通過LC-MS-ESI-TOF分析，得到兩組大鼠尿液代謝譜圖數(shù)據(jù)，應(yīng)用BRUKER自帶軟件ProfileAnalyst對上述數(shù)據(jù)進(jìn)行峰對齊后歸一化降維處理，導(dǎo)出數(shù)據(jù)，應(yīng)用SIMCA-P 11.5進(jìn)行主成分分析（PCA），以及偏最小二乘法分析（PLS-DA），分別見圖2，圖3[8]。應(yīng)用ProfileAnalyst對實驗組和對照組數(shù)據(jù)進(jìn)行分組處理，見圖4；提取主要差異物，見表3。

圖2 PCA模型矩陣

圖3 PLS-DA模型矩陣

圖4 大鼠急性胰腺炎模型尿液代謝組學(xué)差異圖譜

3 討論

胰腺是人體最重要的消化器官之一，它與人體蛋白質(zhì)、脂肪和糖類的代謝直接相關(guān)，一旦胰腺發(fā)生炎癥，可導(dǎo)致人體營養(yǎng)物質(zhì)代謝紊亂。應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)研究疾病發(fā)病機(jī)理，實現(xiàn)早期診斷或進(jìn)行藥物療效觀察，已經(jīng)成為研究熱點[9-10]。該技術(shù)關(guān)鍵在于尋找疾病個體代謝差異物質(zhì)，對方法的可靠性要求較高。AP發(fā)病前后體內(nèi)代謝物質(zhì)會發(fā)生較大變化，但是人體AP發(fā)病機(jī)制多樣，臨床樣本采集不易控制，所以本文利用大鼠建立誘因單一，可重復(fù)性高的急性胰腺炎模型，開發(fā)了LC-MS-ESI-TOF分析方法，并對其精密度進(jìn)行了考察。本分析方法正譜、負(fù)譜RSD均小于10%，重復(fù)性良好。

實驗中應(yīng)用成熟造模方法建立了大鼠AP模型，并對尿液進(jìn)行收集、測定和分析。大鼠模型組與對照組正譜、負(fù)譜PCA分析均得到較好區(qū)分。其中負(fù)譜對照組樣本個別點與模型組未完全區(qū)分，但是對照組樣本整體分布集中，可以判斷為樣本個體差異所致，增加樣本量后會改善。

因為PCA分析為無監(jiān)督的模式識別方法，所以導(dǎo)致數(shù)據(jù)區(qū)分不明顯。我們對上述數(shù)據(jù)進(jìn)行PLS-DA分析，大鼠模型組與對照組正譜、負(fù)譜PLS-DA分析均得到良好區(qū)分，結(jié)果表明模型組與對照組尿液成分存在明顯差別。應(yīng)用軟件Profile-Analyst對數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析，結(jié)果以點陣的方式將數(shù)據(jù)分別顯示出來，每一個點代表一個分子量信息，模型組與對照組大鼠共性成分集中分布，差異成分散布在四周，距離密集中心越遠(yuǎn)的點表明差異越大，結(jié)果進(jìn)一步證明模型組大鼠與對照組大鼠存在明顯差異。經(jīng)過數(shù)據(jù)提取，得到一系列差異物質(zhì)，結(jié)合胰腺炎疾病特點，列出其最可能的物質(zhì)成分。差異代謝物的發(fā)現(xiàn)僅僅是第一步，只有明確代謝物的準(zhǔn)確成分才能進(jìn)一步對模型進(jìn)行研究。目前常用的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫有NIST、MassBank、HMDB、METLIN等。本實驗主要應(yīng)用HMDB對代謝物進(jìn)行了分子量搜索，發(fā)現(xiàn)差異成分主要為糖類、脂類成分代謝物。

表3 大鼠急性胰腺炎模型尿液代謝組學(xué)分析差異物

本研究建立了符合精密度要求的尿液代謝組學(xué)分析方法，并應(yīng)用該方法發(fā)現(xiàn)了大鼠AP造模后尿液主要成分的變化，為AP的深入研究提供了有效手段。隨著研究的深入，能夠為AP發(fā)病機(jī)理及臨床藥效觀察提供研究基礎(chǔ)。

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（收稿：2013-01-16 修回：2013-08-18）

（責(zé)任編輯 王 豐）

Urine Metabolomics of Acute Pancreatitis Rats Based on Q-TOF Technique

GUAN Xin,WANG Yu-xin,TU Zheng-wei,et al.Tianjin Acute Abdominal Diseases Institute,Tianjin(300100),China

Objective To investigate metabolic changes in the urine of experimental acute pancreatitis (AP)rats using Q-TOF technique.MethodsTwelve male Wistar rats were randomly divided into model group and control group.Acute pancreatitis was induced by a retrograde injection of 3%sodium taurocholate in?to the pancreatic duct.Urine was collected for 24 hours following the AP induction.After extraction,samples were assayed by LC-ESI-Q-TOF-MS in both positive and negative modes.Data was analyzed by principal anal?ysis(PCA)and partial least squares discriminant analysis(PLS-DA)to discover metabolites.ResultsThe urine metabolic pattern of AP model group had changes compared with the control group and showed 18 poten?tial biomarkers.ConclusionMetabolomics method can distinguish the AP rats from controls.It is an effective pathway to find unknown biological markers.

Acute pancreatitis;LC-MS;urine metabolomics;rat;biomarker

Q95-33;R657.5+1

A

1007-6948(2013)05-0522-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2013.05.012

天津市衛(wèi)生局科技攻關(guān)項目（10KG116）

天津市中西醫(yī)結(jié)合急腹癥研究所（天津 300100）

劉洪斌，E-mail：jtss@sina.com