崔立華，張 一，白景瑞，李東華，劉洪斌

實(shí)驗(yàn)研究

雨蛙素腹腔注射致小鼠慢性胰腺纖維化病理組織學(xué)觀察

崔立華，張 一，白景瑞，李東華，劉洪斌

目的：采用雨蛙素反復(fù)腹腔注射誘導(dǎo)小鼠慢性胰腺炎，評(píng)估胰腺發(fā)生纖維化的程度及病變特點(diǎn)。方法：健康雄性C57BL/6小鼠20只，隨機(jī)分為兩組，模型組反復(fù)腹腔注射雨蛙素，對(duì)照組腹腔注射與模型組等體積的生理鹽水，于第7周第1 d留取胰腺組織，光鏡下進(jìn)行胰腺腺泡細(xì)胞萎縮、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、間質(zhì)纖維組織增生評(píng)分；另一部分行苦味酸-天狼星紅染色，偏振光顯微鏡下觀察胰腺間質(zhì)膠原增生情況；第三部分行免疫組織化學(xué)染色，觀察α-SMA表達(dá)情況。結(jié)果：模型組小鼠胰腺HE染色顯示明顯腺泡細(xì)胞萎縮、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維化；苦味酸-天狼星紅染色顯示顯著胰腺間質(zhì)膠原增生，評(píng)分明顯升高；免疫組織化學(xué)染色顯示星狀細(xì)胞活化標(biāo)志物α-SMA表達(dá)明顯增強(qiáng)。結(jié)論：雨蛙素反復(fù)多次腹腔注射可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生明顯的胰腺纖維化病變，纖維化發(fā)生機(jī)制可能與胰腺星狀細(xì)胞活化分泌過(guò)多細(xì)胞外間質(zhì)有關(guān)。

雨蛙素；慢性胰腺炎；纖維化；胰腺星狀細(xì)胞；小鼠

慢性胰腺炎典型病理表現(xiàn)是胰腺纖維化，本質(zhì)是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的合成增多、降解相對(duì)減少導(dǎo)致的ECM沉積[1-2]。胰腺星狀細(xì)胞活化轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞合成大量膠原纖維，是導(dǎo)致胰腺纖維化的關(guān)鍵步驟，α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）表達(dá)是胰腺星狀細(xì)胞活化的主要標(biāo)志[3-4]。雨蛙素是一種膽囊收縮素類似物,可刺激胰腺外分泌部，使胰蛋白水解酶分泌大量增加，從而引起胰腺腺泡的自溶。原主要用于建立急性水腫型胰腺炎動(dòng)物模型[5-6]，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，其多次注射可造成胰腺慢性炎癥[7]。因此本文采用大劑量雨蛙素反復(fù)腹腔注射誘導(dǎo)小鼠慢性胰腺炎,評(píng)估胰腺發(fā)生纖維化的程度及病變特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 健康雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量19～22 g，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所。

1.2 主要試劑與儀器 雨蛙素為Sigma產(chǎn)品，以無(wú)菌生理鹽水配成1 mg/mL，置冰箱保存。用時(shí)以無(wú)菌生理鹽水稀釋成所需濃度。天狼星紅購(gòu)自Fluka公司。山羊抗小鼠α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）抗體購(gòu)自Santa Cruz公司。DM4000B型研究級(jí)顯微鏡、RM 2235型輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)、ASP300型全自動(dòng)組織脫水機(jī)均為德國(guó)Leica公司產(chǎn)品，BX53型偏振光顯微鏡為日本OLYMPUS公司產(chǎn)品。

1.3 模型制作及分組 雨蛙素注射方法參考有關(guān)文獻(xiàn)并加以改進(jìn)[8]。健康雄性C57BL/6小鼠20只，隨機(jī)分為兩組。模型組每周一、三、五連續(xù)6周腹腔注射雨蛙素，6次/d，注射間隔為1 h，劑量每次50 μg/kg。對(duì)照組腹腔注射與模型組等體積的生理鹽水，注射方案與模型組相同。

1.4 標(biāo)本留取方法 將動(dòng)物于第7周第1 d腹腔注射麻醉，留取胰腺組織，福爾馬林固定。一部分行HE染色，觀察胰腺腺泡細(xì)胞萎縮、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、間質(zhì)纖維組織增生情況；另一部分行苦味酸-天狼星紅染色，偏振光顯微鏡下觀察胰腺間質(zhì)膠原增生情況；第三部分行免疫組織化學(xué)染色，觀察α-SMA表達(dá)情況。

1.5 HE普通病理組織學(xué)觀察及評(píng)分 取一部分胰腺組織10%中性甲醛溶液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，5 μm切片，行HE染色，光鏡下觀察。按有關(guān)文獻(xiàn)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行胰腺腺泡細(xì)胞萎縮、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維化程度評(píng)分[9]。

1.6 苦味酸-天狼星紅染色觀察胰腺間質(zhì)膠原增生情況 采用飽和苦味酸-天狼星紅染色法。切片脫蠟水化，蒸餾水洗3次，入飽和苦味酸-天狼星紅液染15 min，流水沖洗浮色，無(wú)水乙醇分化，鏡下控制染色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光鏡下膠原纖維呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，觀察胰腺組織中膠原沉積部位。偏振光顯微鏡觀察纖維化區(qū)域膠原成分。每張飽和苦味酸-天狼星紅膠原染色切片，在100倍光鏡下任選10個(gè)視野，拍照后運(yùn)用Leica Image Analysis軟件，采用累積光密度值(IOD)作為參數(shù)對(duì)胰腺組織中膠原纖維表達(dá)進(jìn)行半定量分析。

1.7 免疫組織化學(xué)染色觀察α-SMA表達(dá)情況 胰腺組織切片常規(guī)脫蠟至水，加入1∶100稀釋兔抗小鼠α-SMA一抗，4℃過(guò)夜（PBS代替一抗作陰性對(duì)照），然后加入羊抗兔IgG-HRP作用30 min。DAB顯色,蘇木精復(fù)染。以細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)黃、棕色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。細(xì)胞的著色強(qiáng)度可分為以下級(jí)數(shù)：(-)為細(xì)胞無(wú)著色；(+)為細(xì)胞漿淡棕黃色；(++)為中度棕黃色；(+++)為深度棕黃色。用Leica Image Analysis軟件，對(duì)各組切片單位面積陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行定量分析，每張切片任取10個(gè)視野取其平均值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，均數(shù)之間的差異采用t檢驗(yàn)，P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理組織學(xué)觀察及評(píng)分 對(duì)照組胰腺組織小葉結(jié)構(gòu)基本正常；模型組胰腺組織中小葉腺泡萎縮、消失，小葉間質(zhì)明顯纖維組織增生，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（見圖1）；與對(duì)照組比，模型組腺泡萎縮、炎細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維化程度評(píng)分均顯著升高（見表1）。

圖1 胰腺組織HE染色（200×）

表1 兩組小鼠模型胰腺病理組織學(xué)評(píng)分比較()

表1 兩組小鼠模型胰腺病理組織學(xué)評(píng)分比較()

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.01

組別對(duì)照組模型組n 10 10腺泡萎縮0 2.54±0.42a炎細(xì)胞浸潤(rùn)0 3.47±0.33a纖維化程度0 3.26±0.41a

2.2 飽和苦味酸天狼星紅膠原染色觀察胰腺間質(zhì)膠原增生情況 應(yīng)用圖像分析軟件對(duì)苦味酸-天狼星紅膠原染色圖片進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，雨蛙素反復(fù)腹腔注射6周模型組小鼠胰腺組織中膠原纖維含量較對(duì)照組明顯增多，見表2，且以黃、橙、紅色的粗纖維狀Ⅰ型膠原纖維為主，而細(xì)長(zhǎng)的綠色Ⅲ型膠原纖維較少，見圖2。

2.3 胰腺組織內(nèi)α-SMA表達(dá)情況 對(duì)照組胰腺組織α-SMA陽(yáng)性染色細(xì)胞稀少，偶見于胰管壁，而模型組胰腺組織α-SMA陽(yáng)性染色細(xì)胞顯著增多，廣泛分布于腺泡周圍及小葉間質(zhì)，見圖3。單位面積陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行定量分析顯示模型組顯著高于對(duì)照組，見表3。

表2 兩組小鼠胰腺組織膠原表達(dá)情況()

表2 兩組小鼠胰腺組織膠原表達(dá)情況()

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.01

組別對(duì)照組模型組n 10 10累積光密度0.86±0.67 21.25±3.24a

圖2 胰腺組織飽和苦味酸-天狼星紅染色

圖3 胰腺組織α-SMA免疫組化染色

表3 兩組小鼠胰腺星狀細(xì)胞活化狀態(tài)()

表3 兩組小鼠胰腺星狀細(xì)胞活化狀態(tài)()

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.01

組別對(duì)照組模型組n 10 10單位面積a-SMA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)0.15±0.005 12.23±2.13a

3 討論

慢性胰腺炎是由不同因素造成胰腺組織和功能持續(xù)性損害，最終導(dǎo)致胰腺內(nèi)外分泌功能的永久性喪失，胰腺纖維化是其典型病理表現(xiàn)之一。胰腺纖維化主要表現(xiàn)為組織中的細(xì)胞外基質(zhì)組成和數(shù)量上的病理性改變，直接源于ECM合成和降解的失衡。文獻(xiàn)報(bào)道，胰腺纖維化時(shí)主要的基質(zhì)成分包括Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原以及纖維連接蛋白和層黏蛋白[10]。本研究顯示，雨蛙素反復(fù)腹腔注射6周，模型組小鼠產(chǎn)生了明顯的胰腺慢性炎癥及纖維化病變。膠原纖維主要分布于胰導(dǎo)管、血管及萎縮變性的腺泡細(xì)胞旁，破壞的腺泡、小葉間的胰腺間質(zhì)呈廣泛的纖維化，偏振光顯微鏡顯示膠原成分主要以Ⅰ型膠原為主，Ⅲ型膠原次之。應(yīng)用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)對(duì)膠原表達(dá)量進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示，模型組小鼠胰腺膠原表達(dá)量較對(duì)照組顯著增高,證實(shí)雨蛙素反復(fù)腹腔注射可以導(dǎo)致小鼠胰腺的明顯纖維化。

苦味酸-天狼星紅是一種作用很強(qiáng)的酸性染料，可與膠原分子牢固結(jié)合，吸附穩(wěn)定，不易褪色[11]。天狼星紅染料分子呈長(zhǎng)形展開，在長(zhǎng)軸方向以彼此平行的方式附著于每個(gè)膠原分子，膠原的雙折射性明顯增強(qiáng)，因而入射的正交偏光由于雙折射而發(fā)生的光干涉明顯，不同折射率表現(xiàn)出不同的干涉色和折射強(qiáng)度。Ⅰ型膠原纖維由多個(gè)原纖維粒合成，成熟、粗大，折射率強(qiáng)，故偏光鏡下呈亮黃、橙或紅色粗纖維狀。Ⅲ型膠原纖維以原纖維形式存在，纖細(xì)、幼稚，折射率弱，故偏光下為細(xì)長(zhǎng)的綠色纖維。因此，苦味酸-天狼星紅膠原染色法操作簡(jiǎn)便、膠原形態(tài)和分布顯示清晰，結(jié)果穩(wěn)定可長(zhǎng)期保存，同一切片中Ⅰ/Ⅲ型膠原顏色對(duì)比鮮明。

苦味酸-天狼星紅染液可使膠原纖維特異性地染成猩紅色，非膠原纖維部分不見猩紅色背景，這樣的染色結(jié)果使得膠原纖維的圖像識(shí)別效果良好，能進(jìn)行定量研究，是顯示膠原和研究纖維性病變的較好方法。而Masson三色染色法、VG染色等特殊染色雖能表達(dá)膠原總體的變化，但不能同時(shí)區(qū)分Ⅰ、Ⅲ型膠原，且易褪色，不易長(zhǎng)久保存。免疫組化染色雖能區(qū)分Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維，但不能在同一切片中同時(shí)反映兩種膠原(Ⅰ/Ⅲ型)的變化，不利于綜合分析，且操作繁瑣。本文采用的苦味酸天狼星紅-偏振光法，是一種操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、效果鮮明的膠原顯示法。

胰腺星狀細(xì)胞在慢性胰腺纖維化形成中起重要作用[12]。胰腺損傷后，胰腺星狀細(xì)胞被激活并處于持續(xù)激活狀態(tài)，繼而轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，合成并分泌ECM，最終可導(dǎo)致胰腺纖維化。多項(xiàng)研究表明，胰腺纖維化的本質(zhì)是膠原為主的ECM合成增多，降解減少，導(dǎo)致過(guò)多的ECM沉積。活化的胰腺星狀細(xì)胞是受損胰腺中合成ECM，導(dǎo)致纖維化發(fā)生的主要效應(yīng)細(xì)胞。胰腺星狀細(xì)胞的增生和活化是胰腺纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，各種致纖維化因素共同通過(guò)胰腺星狀細(xì)胞這一靶細(xì)胞途徑，合成大量的ECM沉積在胰腺，從而導(dǎo)致胰腺纖維化的發(fā)生。本研究中，對(duì)照組胰腺組織α-SMA染色稀少,而模型組胰腺組織α-SMA陽(yáng)性染色細(xì)胞顯著增多，廣泛分布于腺泡周圍及小葉間質(zhì)，通過(guò)單位面積陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行定量分析顯示模型組顯著高于對(duì)照組，可見胰腺星狀細(xì)胞顯著激活。

雨蛙素反復(fù)多次腹腔注射可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生明顯的胰腺慢性炎癥及纖維化病變，是一種較為理想的慢性胰腺炎模型。胰腺星狀細(xì)胞活化在纖維化過(guò)程中有重要作用?？辔端崽炖切羌t偏振光法是一種有效的研究纖維化的膠原顯示法。

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（收稿：2013-04-06 修回：2013-07-20）

（責(zé)任編輯 王 豐）

Pancreatic Fibrosis in Mice Induced by Intraperitoneal Injection of Cerulein

CUI Li-hua,ZHANG Yi,BAI Jing-rui,et al. Department of Pharmacology,Tianjin Acute Abdominal Diseases Institute,Tianjin(300100), China

Objective To observe the pathological characteristics of the fibrosis in the mouse model of chronic pancreatitis(CP).MethodsTwenty male C57BL/6 mice were divided into two groups（10 animals per group).The model mice received repeated intraperitoneal injection of cerulein.The control group mice received saline injections.Seven weeks after the first intraperitoneal injection the pancreas was removed for pathological assessment of acinar atrophy,inflammatory infiltration and fibrosis.The second part was stained with picric-siri?us red and observed by polarized light microscopy.The third part of pancreatic specimen was used to examine α-smooth muscle actin(α-SMA)expression by immunohistochemical method.ResultsAll mice that received cerulein injections displayed histopathological signs of chronic pancreatitis with significant acinar atrophy,in?flammatory infiltration and fibrosis.Picric-sirius red staining suggested a significant increase of collagen in the pancreas of the model mice.In addition,the α-SMA expression in pancreas was increased markedly in model mice compared with the control group mice.ConclusionRepeated intraperitoneal injection of cerulein could induce significant chronic pancreatic fibrosis.The pathogenesis was associated with increased number of activat?ed pancreatic stellate cells and their secreted extracellular matrix.

Cerulein;chronic pancreatitis;fibrosis;pancreatic stellate cell;mice

Q95-33;R657.5+1

A

1007-6948(2013)05-0518-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2013.05.011

天津市中西醫(yī)結(jié)合急腹癥研究所藥理學(xué)研究室（天津 300100）

劉洪斌，E-mail：jtss@sina.com