張麗華，康貝貝，張偉，楊本利，李曉捷，王立蘋，張士嶺

粒細(xì)胞集落刺激因子結(jié)合行為訓(xùn)練對(duì)缺血性腦損傷大鼠早期干預(yù)的研究①

張麗華1,2，康貝貝1，張偉1，楊本利1，李曉捷2，王立蘋2，張士嶺2

目的 探討粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)結(jié)合行為訓(xùn)練對(duì)缺血性腦損傷大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及對(duì)遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)記憶能力的影響。方法2月齡清潔級(jí)Wistar大鼠96只，分為假手術(shù)組(A組)、模型組(B組)，G-CSF干預(yù)組(C組)及G-CSF+行為訓(xùn)練組(D組)。采用改良線栓法制作大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)2 h再灌注24 h模型(A組不插入線栓)。各組分別于造模成功后1周、2周、4周、8周隨機(jī)選取6只，利用穿梭實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)計(jì)算逃避潛伏總時(shí)間，HE染色和免疫組織化學(xué)染色觀察造模后大鼠海馬區(qū)病理變化及神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、G-CSF水平。結(jié)果造模后，B組NGF、G-CSF表達(dá)短暫升高，C、D組表達(dá)總體上高于B組，尤以D組為著(P＜0.05)；逃避潛伏總時(shí)間各組均延長(zhǎng)，總體上B組長(zhǎng)于C組，C組長(zhǎng)于D組(P＜0.05)。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，這一趨勢(shì)更加明顯。結(jié)論結(jié)合行為訓(xùn)練較單一應(yīng)用G-CSF神經(jīng)保護(hù)作用更強(qiáng)，且顯著提高遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)記憶能力。

缺血性腦損傷；粒細(xì)胞集落刺激因子；行為訓(xùn)練；早期干預(yù)

[本文著錄格式]張麗華，康貝貝，張偉，等.粒細(xì)胞集落刺激因子結(jié)合行為訓(xùn)練對(duì)缺血性腦損傷大鼠早期干預(yù)的研究[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2013,19(3):231-234.

近年來(lái)大量研究發(fā)現(xiàn)，粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor,G-CSF)對(duì)缺血性腦損傷大鼠具有近期神經(jīng)保護(hù)作用，但對(duì)其長(zhǎng)期保護(hù)作用并不清楚。舒細(xì)記等研究表明，行為訓(xùn)練可增加樹突棘密度，擴(kuò)大突觸聯(lián)系范圍，增強(qiáng)空間學(xué)習(xí)記憶能力[1]。本研究觀察G-CSF結(jié)合行為訓(xùn)練對(duì)缺血性腦損傷大鼠學(xué)習(xí)記憶及神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor,NGF)表達(dá)及遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)記憶能力的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

2月齡健康Wista大鼠96只，清潔級(jí)，雌雄各半，體重(200±30)g，由大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，常規(guī)喂養(yǎng)。

1.2 模型制備與分組

改良的線栓法[2]制備大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型。大鼠蘇醒后參照Longa評(píng)分，1～3分動(dòng)物入選。造模成功動(dòng)物隨機(jī)分為3組：B組為非干預(yù)組，C組為G-CSF干預(yù)組，D組為G-CSF+行為訓(xùn)練組；另設(shè)假手術(shù)組(A組)，造模過(guò)程中不插入線栓，其余操作同其他各組；每組24只，分1周、2周、4周、8周4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各6只。

1.3 干預(yù)方法

A、B組不給予任何干預(yù)，常規(guī)飼養(yǎng)。C、D組于造模成功當(dāng)天皮下注射G-CSF 50 μg/kg，每天1次，連續(xù)5 d。D組同時(shí)結(jié)合Morris水迷宮行為訓(xùn)練：采用Morris水迷宮，將大鼠從任意一點(diǎn)放入水池，2 min后將其撈出，休息10 min再訓(xùn)練2 min，每天上午進(jìn)行3次訓(xùn)練，連續(xù)2周。

1.4 觀察指標(biāo)

利用穿梭實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)檢測(cè)，記錄其逃避潛伏總時(shí)間，逃避潛伏總時(shí)間越短說(shuō)明大鼠主動(dòng)回避反應(yīng)越迅速，學(xué)習(xí)記憶能力越強(qiáng)。腦組織常規(guī)HE染色，光鏡下觀察大腦皮質(zhì)、海馬、齒狀回顆粒下層等部位腦組織病理改變；NGF、G-CSF免疫組織化學(xué)試劑盒(北京博奧森生物工程有限公司)檢測(cè)海馬CA3區(qū)NGF和G-CSF表達(dá)。CH30光學(xué)顯微鏡及自動(dòng)成像系統(tǒng)(日本OLYMPUS)及顯微圖像分析系統(tǒng)(日本尼康)觀測(cè)其灰度值變化，表達(dá)水平越高，染色越深，灰度值越小。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用(±s)表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)，多組之間的比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 穿梭實(shí)驗(yàn)

各時(shí)間點(diǎn)A組無(wú)明顯變化，B、C、D組潛伏總時(shí)間均明顯長(zhǎng)于A組(P＜0.01)。造模后1周時(shí)，B、C、D組潛伏總時(shí)間無(wú)顯著性差異。2周、4周時(shí)，D、C兩組潛伏總時(shí)間較B組縮短，D組較C組縮短(P＜0.05)。8周時(shí)，D組潛伏總時(shí)間較B、C兩組明顯縮短(P＜0.01)，B、C組間無(wú)顯著性差異。見表1。

2.2 HE染色

假手術(shù)組海馬CA3區(qū)錐體細(xì)胞排列整齊，高倍鏡下可見錐體細(xì)胞核大而圓、核仁明顯。缺血再灌注各組海馬區(qū)錐體細(xì)胞體積縮小，核固縮深染，間質(zhì)水腫明顯，可見大量壞死灶。D組神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整，排列相對(duì)規(guī)則，間質(zhì)水腫明顯減輕，壞死灶面積明顯縮小。

2.3 NGF的表達(dá)

造模1周，B、C、D組NGF表達(dá)水平均高于A組，C、D組間無(wú)顯著性差異，但都高于B組(P＜0.05)。2周、4周時(shí)，B組NGF表達(dá)降至基礎(chǔ)水平，C、D組NGF表達(dá)均高于B組，D組高于C組(P＜0.05)。造模后8周，D組NGF表達(dá)水平明顯高于B、C兩組(P＜0.01)。見表2、圖1。

2.4 G-CSF的表達(dá)

造模1周，B、C、D組G-CSF表達(dá)水平均高于A組，C、D組間無(wú)顯著性差異，但都高于B組(P＜0.05)。2周時(shí)，B組G-CSF表達(dá)降至基礎(chǔ)水平，C、D組G-CSF表達(dá)均高于B組，C、D組間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。造模后4周、8周，D組G-CSF表達(dá)水平高于B、C兩組(P＜0.05)；C組降至基礎(chǔ)水平，與B組無(wú)顯著性差異。見表3。

表1 各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)逃避潛伏總時(shí)間(s)

表2 各時(shí)間點(diǎn)海馬CA3區(qū)NGF的灰度值變化

表3 各時(shí)間點(diǎn)海馬CA3區(qū)G-CSF的灰度值變化

圖1 海馬CA3區(qū)NGF表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，100×)

3 討論

腦血管病是目前神經(jīng)系統(tǒng)的常見病和多發(fā)病，其中缺血性腦血管病在腦卒中的發(fā)生率高達(dá)80%，且無(wú)特效治療方法[3]。缺血性腦損傷后，不僅存在運(yùn)動(dòng)功能障礙，很多患者還遺留有學(xué)習(xí)記憶障礙[4]。

G-CSF是一種多肽鏈的細(xì)胞生長(zhǎng)因子，能動(dòng)員骨髓干細(xì)胞增殖，并向腦內(nèi)遷移分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞[5-6]。Hasselblatt等用大鼠模型證實(shí)，G-CSF以化學(xué)激活方式刺激遷移至腦損傷組織的干細(xì)胞釋放某種營(yíng)養(yǎng)因子，促進(jìn)其在腦內(nèi)分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞[7]。

NGF是一種神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子，它對(duì)中樞及周圍神經(jīng)元的發(fā)育、分化、生長(zhǎng)、再生和功能特性的表達(dá)均具有重要的調(diào)控作用，增加腦的可塑性，提高腦損傷大鼠學(xué)習(xí)記憶能力[8]。

本研究觀察G-CSF對(duì)缺血性腦損傷大鼠NGF表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，在2、4周時(shí)，G-CSF干預(yù)組NGF表達(dá)均明顯高于非干預(yù)組，且學(xué)習(xí)記憶能力較非干預(yù)組也有提高。其作用機(jī)制可能是在腦損傷或缺血狀態(tài)下，G-CSF以化學(xué)激活方式動(dòng)員骨髓干細(xì)胞進(jìn)入外周血，選擇性遷移至腦缺血部位；G-CSF刺激神經(jīng)干細(xì)胞釋放NGF，促進(jìn)干細(xì)胞在腦內(nèi)分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)受損組織的重塑和功能重建，提高學(xué)習(xí)記憶能力。繼續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)，8周時(shí)G-CSF干預(yù)組NGF表達(dá)降至基礎(chǔ)水平，學(xué)習(xí)記憶能力與非干預(yù)組無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，表明G-CSF不能發(fā)揮長(zhǎng)期保護(hù)作用，對(duì)遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)記憶能力的提高作用并不明顯。

學(xué)習(xí)記憶障礙是腦缺氧缺血損傷所致的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥之一。海馬對(duì)缺血性損傷較敏感，而海馬又是學(xué)習(xí)記憶能力最重要的功能區(qū)，其損傷可以導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知障礙。江山等研究顯示，行為訓(xùn)練可以增加海馬梗死后大鼠齒狀回區(qū)NGF的表達(dá)，增強(qiáng)大鼠海馬梗死后腦組織的修復(fù)能力，促進(jìn)神經(jīng)功能的重建[9]。本實(shí)驗(yàn)聯(lián)合應(yīng)用G-CSF與行為訓(xùn)練對(duì)腦缺血大鼠進(jìn)行早期干預(yù)，結(jié)果顯示G-CSF+行為訓(xùn)練組NGF表達(dá)及學(xué)習(xí)記憶能力均明顯高于單一使用G-CSF組；第8周時(shí)，G-CSF+行為訓(xùn)練組NGF和G-CSF表達(dá)仍維持在較高水平，學(xué)習(xí)記憶能力接近假手術(shù)組。推測(cè)行為訓(xùn)練能夠刺激腦內(nèi)細(xì)胞分泌G-CSF，使腦內(nèi)G-CSF長(zhǎng)時(shí)間維持在較高水平，并促進(jìn)NGF表達(dá)增加，發(fā)揮長(zhǎng)期神經(jīng)保護(hù)作用，提高遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)記憶能力。

綜上所述，G-CSF結(jié)合行為訓(xùn)練較單一應(yīng)用G-CSF不僅神經(jīng)保護(hù)作用明顯增強(qiáng)，而且作用時(shí)間長(zhǎng)，并能提高遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)記憶能力。

[1]舒細(xì)記,柳威,周紅艷,等.G-CSF干預(yù)對(duì)老齡慢性腦缺血大鼠模型認(rèn)知改善與膠質(zhì)細(xì)胞可塑性的影響[J].中國(guó)老年學(xué)雜志,2011,31(3):450-452.

[2]Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke,1989,20:84-91.

[3]杜家琇,婁季宇,白宏英,等.環(huán)孢素A對(duì)大鼠急性腦缺血再灌注損傷小膠質(zhì)細(xì)胞的活化及iNOS表達(dá)的影響[J].中國(guó)實(shí)用神經(jīng)疾病雜志,2010,13(24):8-10.

[4]陳浩,畢竹梅,崔寧,等.不同時(shí)間窗高壓氧對(duì)腦缺血-再灌注大鼠模型學(xué)習(xí)記憶功能的影響[J].中國(guó)老年學(xué)雜志,2007,27 (15):1447-1449.

[5]Schneider A,Kuhn HG,Schabitz WR.A role for G-CSF(granulocyte colony stimulating factor)in the central nervous system[J].Cell Cycle,2005,4:1753-1757.

[6]Schneider A,Kruger C,Steigleder T,et al.The hematopoietic factor G-CSF is a neuronal ligand that counteracts programmed cell death and drives neurogenesis[J].J Clin Invest, 2005,115:2083-2098.

[7]Hasselblatt M,Jeibmann A,Riesmeier B,et al.Granulocyt-colony stimulating factor(G-CSF)and G-CSF receptor expression in human ischemic stroke[J].Acta Neuropathol,2007,113: 45-51.

[8]Burkhalter J,Fiumelli H,Allaman I,et al.Brain-derived neurotrophic factor stimulates energy metabolism in developing cortical neurons[J].J Neurosci,2003,23(23):212-220.

[9]江山,李玲,袁華,等.行為學(xué)訓(xùn)練對(duì)大鼠海馬梗死后齒狀回區(qū)神經(jīng)生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2006,12 (3):207-209.

Early Intervention of Granulocyte Colony Stimulating Factor Combined with Behavior Training for Ischemic Brain Injury in Rats

ZHANG Li-hua,KANG Bei-bei,ZHANG Wei,et al.Rehabilitation Center for Child Cerebral Palsy,Jiamusi 154002,Heilongjiang,China

ObjectiveTo investigate the neuroprotective effect of granulocyte colony stimulating factor(G-CSF)combined with behavior training on the learning and memory abilities of cerebral ischemic injury in rats.Methods96 Wistar rats,2 months old,were divided as sham group(group A),model group(group B),G-CSF group(group C)and G-CSF+training group(group D).Modified middle cerebral artery occlusion(MCAO)was used to establish a ischemia 2 h/reperfusion 24 h model to all the rats,except sham group.6 rats were selected in each group 1,2,4 and 8 weeks after successfully modeled,respectively.The abilities of learning and memory were detected with the latency of shuttle test video analysis system.The pathology of the hippocampus and the expression of nerve growth factor(NGF)and G-CSF were observed with HE and immunohistochemistry staining,respectively.ResultsThe expression of NGF and G-CSF increased in group B transiently,and increased more and longer in the group C and D,especially in group D,as the time passed(P＜0.05).The latency of shuttle test increased in group B,C and D,and gently decreased as the time passed,and the decrease more to less were group D,C and B(P＜0.05).ConclusionThe neuroprotective effects of G-CSF combined with behavior training are strengthened and long term beneficial than G-CSF alone.

ischemic brain injury;granulocyte colony stimulating factor;behavior training;early intervention

R743.3

A

1006-9771(2013)03-0231-04

2012-09-28

2012-11-29)

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(No.12511537)。

1.黑龍江省小兒腦性癱瘓防治療育中心，黑龍江佳木斯市154002；2.佳木斯大學(xué)兒童神經(jīng)康復(fù)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江佳木斯市154002。作者簡(jiǎn)介：張麗華(1957-)，女，黑龍江五?？h人，主任醫(yī)師，主要研究方向：腦損傷的綜合康復(fù)治療。

10.3969/j.issn.1006-9771.2013.03.008