毛 勇，毛 健*，李華鐘，孟祥勇

(1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122)

溶氧控制條件對(duì)雙孢菇發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的影響

毛 勇1,2，毛 健1,*，李華鐘2，孟祥勇1

(1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122)

以雙孢蘑菇(Agaricus bisporus MJ-0811)為實(shí)驗(yàn)菌種，采用5L自控式發(fā)酵罐培養(yǎng)研究溶氧控制條件(攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量)對(duì)雙孢菇發(fā)酵過(guò)程的影響，考察發(fā)酵過(guò)程中菌體生物量、胞外多糖產(chǎn)量、相對(duì)溶氧、葡萄糖含量的變化。結(jié)果表明：攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量對(duì)雙孢菇的菌體生長(zhǎng)和胞外多糖分泌具有顯著的影響，并得出較佳的培養(yǎng)條件為：溫度25℃、攪拌轉(zhuǎn)速160r/min、通氣量0.9vvm，此條件下，培養(yǎng)5d，菌體生物量最高達(dá)20.81g/L，胞外多糖產(chǎn)量最高達(dá)3.75g/L。

雙孢菇；攪拌轉(zhuǎn)速；通氣量；溶氧；胞外多糖

近年來(lái)，隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，微生物多糖的重要生物活性功能已得到越來(lái)越多人的重視，如作為免疫調(diào)節(jié)劑、促進(jìn)細(xì)胞因子生成、抗腫瘤、抗病毒、抗感染、抗消化性潰瘍、抗氧化、防衰老、降血糖等[1-5]。其中真菌多糖也已越來(lái)越引起研究者的重視。真菌多糖的生物活性已得到國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者的證實(shí)[4,6-10]。雙孢菇具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，味道鮮美，其多糖更是一種特殊的生物活性物質(zhì)，具有增強(qiáng)體液免疫和細(xì)胞免疫的功能。但現(xiàn)階段對(duì)雙孢菇的研究多集中于雙孢菇的種植栽培[11]，子實(shí)體和孢柄多糖的提取、生物活性研究等[9,12-16]，也有部分學(xué)者研究了雙孢菇的液體發(fā)酵，但多針進(jìn)行工藝和活性初步研究[17-19]；涉及胞外多糖為生產(chǎn)目的深層發(fā)酵工藝并未得到深入研究。

液態(tài)深層雙孢菇發(fā)酵是一個(gè)不斷耗氧生物降解的過(guò)程[19-20]。隨著發(fā)酵過(guò)程的進(jìn)行，胞外多糖的積累，發(fā)酵液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量都受到發(fā)酵基質(zhì)中溶氧的影響，甚至不利于菌體的生長(zhǎng)，阻礙代謝產(chǎn)物的積累。因而，提高發(fā)酵液的溶氧率是促進(jìn)發(fā)酵進(jìn)程的一個(gè)重要因素。萬(wàn)萍等[21]研究了溶氧調(diào)控對(duì)Alcaligenes sp．NX-3產(chǎn)威蘭膠的影響。結(jié)果表明利用高供氧-中供氧-低供氧的策略能使發(fā)酵液中威蘭膠的含量得到明顯提高。彭志堅(jiān)等[22]研究了供氧方式對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)L-異亮氨酸的影響。結(jié)果表明攪拌速度及攪拌方式對(duì)L-異亮氨酸產(chǎn)量具有顯著影響。然而對(duì)雙孢菇液體深層發(fā)酵的研究相對(duì)較少，目前僅有部分文獻(xiàn)對(duì)雙孢菇液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基和菌種的研究[18,23-24]進(jìn)行報(bào)道。其中對(duì)發(fā)酵工藝條件的研究，尤其是溶氧條件對(duì)雙孢菇液態(tài)發(fā)酵進(jìn)程的影響更是鮮有報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)雙孢菇液態(tài)發(fā)酵過(guò)程中的攪拌轉(zhuǎn)速、通氣量等溶氧控制條件進(jìn)行研究，分析比較不同的溶氧控制條件對(duì)雙孢菇菌絲體及胞外多糖發(fā)酵過(guò)程的影響，為雙孢菇液態(tài)發(fā)酵的實(shí)際生產(chǎn)提供一定的技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試劑、菌種與培養(yǎng)基

馬鈴薯、玉米漿 市售；葡萄糖、KH2PO4、MgSO4g 7H2O(均為分析純)、蛋白胨 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；瓊脂 上海信然生物技術(shù)有限公司。

雙孢蘑菇(Agaricus bisporus MJ-0811)，為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

PDA培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯200、葡萄糖20、蛋白胨2、KH2PO42、MgSO4g7H2O 1、瓊脂20，pH值自然，121℃滅菌15min；種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20、蛋白胨2、KH2PO42、MgSO4g7H2O 1、玉米漿 15，pH值自然，121℃滅菌15min；發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 20、蛋白胨2、KH2PO42、MgSO4g7H2O 1，121℃滅菌15min，pH 5.0。

1.2 儀器與設(shè)備

PHB-4型酸度計(jì) 上海精科實(shí)業(yè)有限公司；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海市躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠；SIGMA高速離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司；LS-B50型立式圓形壓力蒸汽滅菌 上海醫(yī)用核子儀器廠；R-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Buchi公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基培養(yǎng)條件

種子培養(yǎng)：在活化后的菌種中，選取黃豆粒大小的小塊，接到250mL三角瓶(裝液量50mL培養(yǎng)基)，置于恒溫?fù)u床上，160r/min、30℃培養(yǎng)3d。

5L發(fā)酵罐培養(yǎng)條件：裝料系數(shù)為0.7，接種量為10%，發(fā)酵罐培養(yǎng)溫度為25℃、初始pH5.0，通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速需要實(shí)驗(yàn)確定。每個(gè)實(shí)驗(yàn)水平重復(fù)3次。在發(fā)酵過(guò)程中，每天取樣，觀察菌體形態(tài)，測(cè)定菌體生物量、多糖含量。

1.3.2 胞外多糖的提取和測(cè)定

發(fā)酵液經(jīng)6000r/min離心10min后得上清液，再將上清液濃縮，然后加入3倍體積95%乙醇，劇烈攪拌，4℃沉淀過(guò)夜。沉淀過(guò)夜后，6000r/min離心20min，棄去上清液，沉淀用60℃熱水溶解，溶液于50℃經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮到原來(lái)體積的1/3。然后以料液比1:5(V/V)加入氯仿-戊醇(5:1，V/V)，混合物振搖30min，使蛋白質(zhì)與氯仿-戊醇生成凝膠物而分離，3000r/min離心10min，分去水層和溶劑層交界處的變性蛋白質(zhì)。重復(fù)多次直至兩相交界處無(wú)變性蛋白質(zhì)。然后將樣品進(jìn)行冷凍干燥，即為胞外粗多糖。采用硫酸苯酚法測(cè)定多糖的含量[4]。

1.3.3 菌體生物量的測(cè)定

采用干質(zhì)量法測(cè)菌體生物量：取發(fā)酵液100mL，于4℃、10000r/min離心10min，收集沉淀物置于100目紗布上，用蒸餾水反復(fù)沖洗，然后置于干燥箱中在70℃條件下烘干至恒質(zhì)量。

1.3.4 葡萄糖含量的測(cè)定

采用3,5-二硝基水楊酸比色法(DNS法)[25]測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)雙孢菇發(fā)酵生產(chǎn)胞外多糖的影響

圖 1 攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)雙孢菇菌體生物量的影響Fig.1 Effect of stirring speed on mycelial biomass

微生物發(fā)酵不僅決定于菌種本身，還與菌種的生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)。在深層發(fā)酵過(guò)程中，攪拌不僅影響著基質(zhì)中營(yíng)養(yǎng)素的傳遞，而且影響溶氧水平，對(duì)深層發(fā)酵有著重要的影響[26]。在通風(fēng)量一定(1.0vvm)的情況下，考察了攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)雙孢菇菌體生物量、胞外多糖、溶氧水平、殘?zhí)堑挠绊?。由圖1可知，攪拌轉(zhuǎn)速在120～160r/min內(nèi)，隨著攪拌速率的增加菌絲體量不斷提高。其中當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速為160r/min時(shí)，菌體生長(zhǎng)最快，并且菌體生物量最高，發(fā)酵到第3天時(shí)菌體生物量達(dá)到16.56g/L。但當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速超過(guò)200r/min后，菌體生物量下降，低于120r/min和160r/min轉(zhuǎn)速條件下菌體生物量，原因可能在于較高攪拌轉(zhuǎn)速作用下，剪切作用力較大，菌絲體容易被打斷，造成細(xì)胞損傷，不利于菌體生長(zhǎng)。

圖 2 攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)雙孢菇胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of stirring speed on exopolysacharide production

由圖2可知，經(jīng)過(guò)近3d的培養(yǎng)適應(yīng)期，雙孢菇開始大量分泌胞外多糖。其中轉(zhuǎn)速在160r/min條件下，胞外多糖積累的速度大于其他兩種考察攪拌轉(zhuǎn)速。在轉(zhuǎn)速160r/min條件下培養(yǎng)5d，雙孢菇胞外多糖產(chǎn)量達(dá)到最大2.92g/L，而其他轉(zhuǎn)速(120、200r/min)條件下，胞外多糖的最大產(chǎn)量分別為2.17g/L和2.53g/L，胞外多糖的積累并未隨著攪拌速度的提高而增加。過(guò)高或過(guò)低的攪拌轉(zhuǎn)速都不利于雙孢菇胞外多糖的分泌。由此可以說(shuō)明，恰當(dāng)?shù)臄嚢柁D(zhuǎn)速對(duì)雙孢菇的整個(gè)發(fā)酵過(guò)程非常重要，既要求有利于發(fā)酵前期菌體的生長(zhǎng)，又要有利于中后期發(fā)酵產(chǎn)物胞外多糖的積累。

圖 3 攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)雙孢菇發(fā)酵液相對(duì)溶氧的影響Fig.3 Effect of stirring speed on dissolved oxygen concentration

由圖3可知，發(fā)酵過(guò)程中各轉(zhuǎn)速條件下，發(fā)酵液中相對(duì)溶氧規(guī)律基本相似。在發(fā)酵前期，雙孢菇生長(zhǎng)處于遲滯期，相對(duì)溶氧水平變化??；進(jìn)入快速生長(zhǎng)期后，相對(duì)溶氧迅速下降，此時(shí)菌體細(xì)胞的耗氧速率明顯高于發(fā)酵液中的供氧速率。進(jìn)入穩(wěn)定期后，相對(duì)溶氧一直保持在較低的水平，原因可能在于在發(fā)酵的后期，由于菌體的大量生長(zhǎng)，消耗大量的溶氧。

圖 4 攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)雙孢菇發(fā)酵過(guò)程中葡萄糖含量的影響Fig.4 Effect of stirring speed on residual glucose concentration

在發(fā)酵過(guò)程中，隨著菌體的生長(zhǎng)，還原糖的消耗也相應(yīng)地增加。由圖4可知，攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵液中還原糖消耗的影響。在發(fā)酵前2d還原糖的消耗基本穩(wěn)定，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，由于菌體的生長(zhǎng)造成糖的消耗逐漸增大。在攪拌轉(zhuǎn)速為160r/min時(shí)，還原糖的消耗速率最快，這也跟雙孢菇菌絲體生物量增加相對(duì)應(yīng)。160r/min培養(yǎng)5d時(shí)，葡萄糖含量為11.36g/L，而其他轉(zhuǎn)速(120、200r/min)條件下，葡萄糖含量分別為13.85g/L和15.40g/L。

2.2 通氣量對(duì)雙孢菇發(fā)酵生產(chǎn)胞外多糖的影響

在好氧菌的培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)液中溶解氧水平是一個(gè)非常關(guān)鍵的因素。通氣可以使培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)、代謝產(chǎn)物、副產(chǎn)物和氧氣得到更好的傳遞利用并且使有關(guān)的微生物細(xì)胞發(fā)揮更好的作用，特別是對(duì)絲狀真菌發(fā)酵的影響更為顯著。通氣量對(duì)發(fā)酵液中的溶氧水平起到尤其直接的作用。在攪拌轉(zhuǎn)速一定(150r/min)的情況下，考察了通氣量對(duì)菌體生物量、胞外多糖、溶氧水平、葡萄糖含量的影響。由圖5可知，在通氣量為0.6、0.9、1.2vvm時(shí)，最大菌體生物量分別為12.87、13.98、16.37g/L，表明較高的通氣量比較有利于菌體的生長(zhǎng)。通氣量充足的條件下，充足的空氣有利于細(xì)胞生長(zhǎng)所需O2的供給，這對(duì)菌體生物量的增加是非常重要的。并且在微生物代謝過(guò)程中，充足的通氣還有利于去除代謝過(guò)程中產(chǎn)生的廢氣和促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境的副產(chǎn)品代謝。但是繼續(xù)增加通氣會(huì)使發(fā)酵液中溶氧過(guò)多，不僅影響糖和相關(guān)酶的合成，而且還會(huì)造成酶的氧化，引起酶的失活；最終當(dāng)通氣量增加到一定程度時(shí)，發(fā)酵過(guò)程中胞外多糖的分泌反而減少[27]。

圖 5 通氣量對(duì)雙孢菇菌體生物量的影響Fig.5 Effect of aeration speed on mycelial biomass

圖 6 通氣量對(duì)雙孢菇胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of aeration speed on exopolysacharide production

由圖6可知，當(dāng)通氣量為0.9vvm時(shí)，經(jīng)過(guò)5d的培養(yǎng)，發(fā)酵液中胞外多糖的最大得率2.82g/L；當(dāng)通氣量0.6、1.2vvm時(shí)，最大胞外多糖的得率分別為2.24、2.69g/L，均低于通氣量為0.9vvm時(shí)的胞外多糖得率。當(dāng)通氣量為0.6vvm時(shí)，不足量的O2供給明顯地不利于使雙孢菇胞外多糖的積累，原因可能是在此供氧條件下，只有局部環(huán)境下的微生物細(xì)胞能夠在進(jìn)行正常的代謝活動(dòng)并進(jìn)行生物活性物質(zhì)的積累與轉(zhuǎn)化，而更多的細(xì)胞只能勉強(qiáng)維持自身的生存；但是在1.2vvm的通氣量下，過(guò)量的O2供給也能導(dǎo)致雙孢菇胞外多糖得率的降低(2.69g/L)?？梢钥闯鲚^高或較低的通氣量均不利于胞外多糖的分泌。原因可能在于，隨著通氣量的增加，發(fā)酵液中的溶氧水平也相應(yīng)增加；但是過(guò)高的溶氧會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵液中副產(chǎn)物的增加，從而抑制了雙孢菇菌體生長(zhǎng)和胞外多糖的生成[28]。

圖 7 通氣量對(duì)雙孢菇發(fā)酵液相對(duì)溶氧的影響Fig.7 Effect of aeration speed on dissolved oxygen concentration

由圖7可知，對(duì)于雙孢菇發(fā)酵過(guò)程溶氧水平的變化，基本與攪拌轉(zhuǎn)速的影響趨勢(shì)類似。隨著通氣量的加大，發(fā)酵液中溶氧水平增加，與雙孢菇菌體生物量及胞外多糖得率的增加相對(duì)應(yīng)。隨著發(fā)酵過(guò)程的進(jìn)行，發(fā)酵液中的溶解氧水平不斷下降；尤其是當(dāng)發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行到1～3d時(shí)，發(fā)酵液中的溶解氧下降較為迅速，原因在于在這個(gè)時(shí)期由于菌體大量生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的大量消耗，消耗的氧氣較多，氧氣消耗速率大于氧氣供給率，呈現(xiàn)出迅速下降的狀態(tài)。雙孢菇發(fā)酵進(jìn)入穩(wěn)定期后，通氣量維持在0.6vvm時(shí)，相對(duì)溶氧維持在較低水平(小于10%)，不能滿足菌體生長(zhǎng)和胞外多糖生成所需氧量；而當(dāng)通氣量維持在0.9vvm和1.2vvm時(shí)相對(duì)溶氧水平基本維持在20%～30%之間，基本滿足菌體生長(zhǎng)和胞外多糖的合成分泌。

圖 8 通氣量對(duì)雙孢菇發(fā)酵過(guò)程中葡萄糖含量的影響Fig. 8 Effect of aeration speed on residual glucose concentration

由圖8可知，在雙孢菇發(fā)酵過(guò)程中，隨著通氣量的加大，氧氣供給充足，發(fā)酵液中還原糖消耗的更為徹底，與雙孢菇菌絲體及胞外多糖得率的增加相對(duì)應(yīng)。在通氣量為1.2vvm時(shí)，還原糖的消耗速率最快，這也跟蘑菇菌絲體生物量增殖相對(duì)應(yīng)。當(dāng)通氣量維持在1.2vvm時(shí)，經(jīng)過(guò)5d的培養(yǎng)，發(fā)酵液中的葡萄糖含量為7.36g/L，而在0.6、0.9vvm通氣量條件下，發(fā)酵液中葡萄糖含量分別為12.85g/L和9.40g/L。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過(guò)以上對(duì)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速的研究，初步得出較優(yōu)的溶氧條件：攪拌轉(zhuǎn)速160r/min、通氣量0.9vvm；在初步優(yōu)化的參數(shù)條件下：溫度25℃、攪拌轉(zhuǎn)速160r/min、通氣量0.9vvm，培養(yǎng)5d，雙孢菇菌體生物量最高達(dá)到20.81g/L，胞外多糖產(chǎn)量最高達(dá)到3.75g/L，相對(duì)溶氧為10.35%，葡萄糖含量為9.37g/L，較優(yōu)化前雙孢菇菌體生物量16.37g/L和雙孢菇胞外多糖2.82g/L分別提高了27.1%和33.4%。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在攪拌轉(zhuǎn)速為160r/min時(shí)，雙孢菇菌體生長(zhǎng)較好，轉(zhuǎn)速過(guò)大或過(guò)小都不利于菌體的生長(zhǎng)。過(guò)低導(dǎo)致發(fā)酵液中的溶氧供給不足，不利于菌體的生長(zhǎng)；轉(zhuǎn)速過(guò)高，產(chǎn)生的剪切力較大，菌絲容易被打斷，引起菌體細(xì)胞的損傷，不利于菌體的生長(zhǎng)。適宜的攪拌轉(zhuǎn)速能夠增加雙孢菇胞外多糖的分泌積累，攪拌轉(zhuǎn)速過(guò)高或過(guò)低都對(duì)胞外多糖的分泌不利。菌體生物量隨著通氣量的增加而增加，原因在于通氣量的增加提高了發(fā)酵液中的溶氧水平，供氧充足有利于菌體的生長(zhǎng)。但過(guò)高或過(guò)低的通氣量都不利于胞外多糖的分泌，通氣量過(guò)低，代謝過(guò)程中產(chǎn)生胞外多糖的所需氧氣不足；通氣量過(guò)大，過(guò)多的氧氣會(huì)引起胞外多糖的降解。通過(guò)對(duì)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速的研究，初步得出較優(yōu)的溶氧條件為：攪拌轉(zhuǎn)速160r/min、通氣量0.9vvm；在優(yōu)化的參數(shù)條件下(溫度25℃、攪拌轉(zhuǎn)速 160r/min、通氣量0.9vvm)培養(yǎng)5d，雙孢菇菌體生物量最高達(dá)到20.81g/L，胞外多糖產(chǎn)量最高達(dá)到3.75g/L，相對(duì)溶氧為10.35%，葡萄糖殘留量為9.37g/L，較優(yōu)化前雙孢菇菌體生物量16.37g/L和雙孢菇胞外多糖2.82g/L分別提高了27.1%和33.4%。

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Effect of Dissolved Oxygen Controlling Conditions on Production of Extracellular Polysaccharides by Agaricus bisporus MJ-0811

MAO Yong1,2，MAO Jian1,*，LI Hua-zhong2，MENG Xiang-yong1
(1. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China；2. School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Agaricus bisporus MJ-0811 was cultured in a 5 L automatic fermenter to explore the effect of dissolved oxygen controlling conditions (stirring speed and aeration) on mycelial biomass, extracellular polysaccharide production, dissolved oxygen concentration, and residual glucose concentration. The results showed that stirring speed and aeration rate had signif i cant impact on the growth of Agaricus bisporus MJ-0811 and the production of extracellular polysaccharides. The highest mycelial biomass (20.81 g/L) and extracellular polysaccharides (3.75 g/L) were obtained when Agaricus bisporus MJ-0811 was cultured for 5 d at 25 ℃ with a stirring speed of 160 r/min and an aeration rate of 0.9 vvm.

Agaricus bisporus；stirring speed；aeration；dissolved oxygen；extracellular polysaccharides

TS201.3

A

1002-6630(2013)01-0155-05

2012-09-12

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31271839)

毛勇(1972ü)，男，博士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：mxysong@yahoo.cn

*通信作者：毛健(1970ü)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：biomao@263.net