曲曉軍，沙長(zhǎng)青，李思明，孫建華，于 沖，夏海華，王金英

(1.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱150010;2.黑龍江省科學(xué)院，哈爾濱150001)

乳酸乳球菌(Lactococcus lactis，L.lactis)是乳球菌屬中最典型的一個(gè)種，是乳酸菌的重要模式菌(model LAB)。L.lactis歸屬于硬壁菌門，桿菌綱，乳桿菌目，鏈球菌科，乳球菌屬，細(xì)胞呈球形或卵圓形，革蘭氏陽(yáng)性，兼性厭氧，不產(chǎn)莢膜和芽孢，營(yíng)養(yǎng)要求復(fù)雜，最適宜生長(zhǎng)溫度為30℃。L.lactis廣泛存在于乳制品和植物產(chǎn)品中，在食品工業(yè)中應(yīng)用廣泛，對(duì)人和動(dòng)物無(wú)致病性，是被公認(rèn)安全的食品級(jí)微生物(generally regards as safe，GRAS)。與大腸桿菌、酵母菌相比，L.lactis的分子遺傳學(xué)方面的研究起步較晚，從20世紀(jì)80年代開始，研究者致力于對(duì)其生物學(xué)性質(zhì)和分子機(jī)制的研究。近年來(lái)，L.lactis分子生物學(xué)及作用機(jī)制的研究取得了重大發(fā)展，一系列具有不同用途的L.lactis基因表達(dá)系統(tǒng)已逐步建立，并成功地表達(dá)了許多外源蛋白［1］，加之L.lactis的完整基因組已經(jīng)測(cè)序完成，因此，構(gòu)建重組乳酸乳球菌已成為食品工業(yè)、生物制藥和疫苗研究的熱點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于上述領(lǐng)域內(nèi)。

1 重組L.lactis應(yīng)用于黏膜免疫疫苗

黏膜是許多病原菌進(jìn)入肌體的主要通道，在黏膜表面接種以抵御病原體的入侵，不僅是合理的，在某種程度上也是唯一的途徑，例如在黏膜表面防御寄生蟲和病毒的感染遠(yuǎn)比感染后再消除這些病原體容易［2］。因此，預(yù)防感染的最佳途徑就是激發(fā)作為肌體第一道屏障的黏膜免疫，阻止病原微生物的入侵。Besrdeka于1919年首先提出了黏膜局部免疫防御系統(tǒng)的概念，黏膜免疫的組織結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是由位于胃腸道的孤立淋巴結(jié)和集合淋巴結(jié)為代表的腸道相關(guān)性淋巴組織(Gut associated lymphoid tissue，GALT)、鼻黏膜相關(guān)淋巴組織(Nasal assoeiated lymphoid tissue，NALT)、上呼吸道的支氣管淋巴組織(Bronehus－assoeiated lymphoid tissue，BALT)、泌尿生殖道黏膜下的淋巴組織和眼部的淋巴組織組成。通過(guò)黏膜輸送疫苗抗原能夠刺激GALT產(chǎn)生局部黏膜和全身系統(tǒng)免疫反應(yīng)，局部黏膜分泌型IgA抗體(sIgA)，能夠阻止病毒的感染、細(xì)菌的定植及中和細(xì)菌毒素的活性［3－6］。因此，通過(guò)鼻黏膜、消化道黏膜或婦女陰道黏膜接種疫苗是一種極其有效的免疫途徑。

理想的黏膜免疫活載體疫苗應(yīng)該是安全、穩(wěn)定的，能促使抗原和免疫系統(tǒng)之間的有效接觸，并能刺激體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，單劑量接種后產(chǎn)生長(zhǎng)期的保護(hù)。近年來(lái)發(fā)展了一些新型的抗原遞呈載體，如細(xì)菌、病毒、惰性顆粒及黏膜上皮黏附因子等。將重組細(xì)菌作為抗原遞呈載體是近年來(lái)基因工程主要的發(fā)展方向，目前研究最多的是致弱病原菌載體，如分枝桿菌(mycobacteria)［7］、沙門氏菌(salmonlla)［8］。但因其仍可能保持侵襲性和毒性，對(duì)兒童、老人及部分免疫缺陷者有潛在的危險(xiǎn)，而且過(guò)強(qiáng)的免疫應(yīng)答會(huì)降低后繼疫苗的效力，因此，在應(yīng)用上受到了限制。利用乳酸乳球菌作為抗原遞呈載體是近年來(lái)新興的疫苗研制策略，能夠克服上述缺陷。乳酸乳球菌被公認(rèn)為安全級(jí)微生物，在疫苗研發(fā)方面具有天然的優(yōu)勢(shì)，它不在人和動(dòng)物腸道內(nèi)定居，具有很小的免疫原性，不會(huì)造成免疫麻痹，可重復(fù)用作抗原遞呈載體;攜有多種免疫輔助成分起到免疫修飾作用，如脂多糖、磷脂A及肽聚糖等，可以作為佐劑激活宿主的免疫系統(tǒng)，促進(jìn)細(xì)胞分裂、體液及細(xì)胞免疫［9］;乳酸乳球菌分泌蛋白較少，且不分泌細(xì)胞外蛋白酶，使得其表達(dá)的外源性分泌蛋白易于被檢測(cè)且不易發(fā)生細(xì)胞外降解;易于馴化，其遺傳學(xué)方面的研究及相關(guān)技術(shù)日臻成熟。因此，乳酸乳球菌是一種理想的黏膜免疫疫苗活載體。

目前，以乳酸乳球菌作為載體來(lái)輸送疫苗抗原以激發(fā)黏膜免疫的研究比較深入，已有多種細(xì)菌、病毒的抗原在乳酸乳球菌中表達(dá)并用于口服或鼻黏膜接種研究［10－14］，相關(guān)的免疫原性也給予了闡述。K.Robinson等［15］在乳酸乳球菌中表達(dá)破傷風(fēng)毒素片段C(TTFC)，并以黏膜免疫的方式免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)在小鼠腸道中產(chǎn)生特異性IgA抗體和T細(xì)胞免疫反應(yīng)，而且血清中也出現(xiàn)特異性IgG抗體;ZHANG ZH等［16］給小鼠口服表達(dá)瘧原蟲MSP－1(19)蛋白的乳酸乳球菌，小鼠能夠產(chǎn)生針對(duì)瘧疾的保護(hù)力;Ribeiro等［17］也在乳酸乳球菌中實(shí)現(xiàn)了布魯氏菌L7/L12抗原的表達(dá)。以上試驗(yàn)結(jié)果都表明，乳酸乳球菌可有效地將抗原遞呈于黏膜免疫系統(tǒng)并誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答，證明其具有誘導(dǎo)黏膜免疫應(yīng)答的能力。目前為止，已有多種細(xì)菌及病毒的抗原在乳酸乳球菌中得到有效表達(dá)，如表1所示。

2 重組L.lactis表達(dá)、傳遞功能性蛋白及細(xì)胞因子

采用重組微生物表達(dá)功能性蛋白可以較好地解決傳統(tǒng)藥理學(xué)制備技術(shù)存在的藥物產(chǎn)量低、成本昂貴、蛋白質(zhì)易變性等不足。L.lactis是一種理想的外源蛋白表達(dá)宿主菌，其表達(dá)的外源蛋白在細(xì)胞的定位有胞內(nèi)、胞壁結(jié)合和分泌等形式。分泌性表達(dá)具有極其顯著的優(yōu)勢(shì)，可以持續(xù)培養(yǎng)，及時(shí)將合成的外源蛋白輸送到胞外上清中，避免被胞內(nèi)蛋白酶降解;L.lactis不產(chǎn)生任何細(xì)胞外蛋白酶，有利于保持外源蛋白的完整性和功能性;可避免如大腸桿菌表達(dá)形成包涵體，無(wú)須復(fù)性處理，表達(dá)蛋白能夠正確折疊，保持良好的生物學(xué)活性;分泌性表達(dá)的蛋白或酶可以直接與作用對(duì)象或腸道黏膜接觸，無(wú)須下游的蛋白純化操作，且乳酸乳球菌為腸道益生菌，可在腸道中持續(xù)表達(dá)。目前，乳酸乳球菌已成為重組治療蛋白及細(xì)胞因子表達(dá)載體的研究熱點(diǎn)，已有多種細(xì)胞因子在乳酸乳球菌中表達(dá)［18－19］，如表2所示。

表1 乳酸乳球菌表達(dá)的細(xì)菌及病毒抗原Tab.1 Bacterial and viral antigen of Lactococcus lactis expression

表2 乳酸乳球菌表達(dá)的細(xì)胞因子Tab.2 Cytokines of Lactococcus lactis expression

IL－10是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的具有抗炎作用的細(xì)胞因子，也稱之為細(xì)胞因子合成抑制因子，是一種多功能負(fù)性調(diào)節(jié)因子，主要由Th2細(xì)胞、活化的B細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞產(chǎn)生。它參與免疫細(xì)胞、炎癥細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等多種細(xì)胞的生物調(diào)節(jié)，在自身免疫性疾病、嚴(yán)重感染性疾病、腫瘤及移植免疫等多種疾病中發(fā)揮重要作用。IL－10在炎癥性腸病中是重要的抑炎細(xì)胞因子，常用給藥方法是口服或注射，但均有一定的局限性?？诜o藥會(huì)因胃腸道中的蛋白酶以及胃液的酸性環(huán)境等因素，給細(xì)胞因子的傳遞造成不利的影響;注射給藥會(huì)引起一定的副作用并可導(dǎo)致炎癥因子的誘發(fā)。研究者對(duì)如何將功能性蛋白及細(xì)胞因子有效地傳遞到病灶展開了研究。Steidler，L等［20］給鼠口服表達(dá)分泌型IL－10的乳酸乳球菌，研究發(fā)現(xiàn)，DSS(右旋糖酐硫酸酯鈉)模型鼠的大腸炎發(fā)病率減少了50%;Vandenbroucke，K等［21］亦研究發(fā)現(xiàn)分泌型表達(dá)三葉因子(TFF)的乳酸乳球菌可有效防治急性鼠源大腸炎。以上研究結(jié)果均表明，以重組乳酸乳球菌作為功能性蛋白及細(xì)胞因子的表達(dá)、傳遞載體是完全可行的。

3 結(jié)語(yǔ)

乳酸乳球菌是一種長(zhǎng)期應(yīng)用于食品工業(yè)的有益微生物，近年來(lái)乳酸乳球菌分子生物學(xué)研究進(jìn)展迅速，一系列基因表達(dá)載體和受體系統(tǒng)逐步建立，已構(gòu)建了多種重組乳酸乳球菌。重組乳酸乳球菌及其表達(dá)產(chǎn)物可直接制成口服制劑，避免了一般基因工程菌復(fù)雜、高成本的后期提取工藝，因此，重組乳酸乳球菌在功能食品、醫(yī)療保健及微生態(tài)制劑、人工口服疫苗等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景和巨大的商業(yè)價(jià)值。

［1］ Monne M，Chan KW，Slotboom DJ，et al.Functional expression of eukaryotic membrane proteins in Lactococcus lactis［J］.Protein Sci，2005，(14):3048 －3056.

［2］ Eriksson K，Holmgren J.Recent advances in mueosal vaccines and adjuvants［J］.Curr Opin Immunol，2002，(14):666 －672.

［3］ Brandtzaeg P.Role of secretory antibodies in the defence against infections［J］.Int.J.Med.Microbiol，2003，(293):3 －15.

［4］ Michetti P，Mahan MJ，Slauch JM，et al.Monoclonal secretory immunoglobulin A protects mice against oral challenge with the invasive pathogen Salmonella typhimurium［J］.Infect Immun，1992，(60):1786－1792.

［5］ Taylor HP，Dimmoek NJ.Mechanism of neutralization of influenza virus by secretory IgA is different from that of monomeric IgA or IgG［J］.Exp Med，1985，(161):198 －209.

［6］ Winner L，Mack J，Weltzin R，et al.New model for analysis of mucosal immunity:intestinal secretion of specific monoclonal immunoglobulin A from hybridoma tumors protects against Vibrio cholerae infection［J］.Infect Immun，1991，(59):977 －982.

［7］ Stover CK，de la Cruz JF，Lee MH.New use of BCG for recombinant vaccines［J］.Nature，1991，(351):456 －460.

［8］ Chatfield S N，Dougan G，Roberts M.Progress in the development of multivalent oral vaccines based on live attenuated Salmonella［M］.Plenum press，1994:32 －34.

［9］ Szostak MP，Hensel A，Eko F.Bacterial ghosts:non－living candidate vaccines［J］.Biotechnol，1996，(44):161 －170.

［10］ Norton PM ，Wells JM，Brown HWG，et a1.Protection against tetanus toxin in mice nasally immunised with recombinant Lactococcus lactis expressing tetanus toxin fragment C［J］.Vaccine，1997，(15):616 －619.

［11］ Dieye Y，Hoekman AJ，Clier F，et al.Ability of Lactococcus lactis to export viral capsid antigens:a crucial step for development of live vaccines［J］.Appl Environ Microbiol，2003，(69):7281 －7288.

［12］ Pontes DS，Dorella FA，Ribeiro LA，et al.Induction of partial protection in mice after oral administration of Lactococcus lactis producing Brucella abortus L7/L12 antigen［J］.Drug Target，2003，(11):489－493.

［13］ Bermudez－Humaran LG，Cortez－ Perez NG，Le Loir Y，et al.An inducible surface presentation system improves cellular immunity against human papillomavirus type 16 E7 antigen in mice after nasal administration with recombinant lactococci［J］.Med Mierobiol，2004，(53):427 －433.

［14］ Pei H，Liu J，Cheng Y，et al.Expression of SARS － coronavirus nucleocapsid protein in Escherichia coli and Lactococcus lactis for serodiagnosis and mucosal vaccination［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2005，(68):220 －227.

［15］ Robinson K，Chamberlain LM，Lopez MC，et al.Mucosal and Cellular Immune Responses Elicited by Recombinant Lactococcus lactis Strains Expressing Tetanus Toxin Fragment C［J］.Infection and Immunity，2004，5(72):2753 －2761.

［16］ Zhan ZH，Jiang PH，Li NJ，et al.Oral vaccination of mice against rodent malaria with recombinant Lactococcus lactis expressing MSP －119［J］.World J Gastroenterol，2005，11(44):6975 －6980.

［17］ Ribeiro LA，Azevedo V，Le Loir Y，et al.Production and targeting of the Brucella abortus antigen L7/L12 in Lactococcus lactis:a first step towards food－grade live vaccines against Brucellosis［J］.Appl Environ Microbiol，2002，(68):910 －916.

［18］ Bermudez－Humaran LG，Langella P，Commissaire J，et a1.Controlled intra－orextracellular production of staphylococcal nuclease and ovine omega interferon in Lactococcus lactis［J］.FEMS Microbiol Lett，2003，224(2):307 －313.

［19］ Dieye Y，Usai S，Clier F，et al.Design of a protein － targeting system for lactic acid bacteria［J］.Bacteriol，2001，l83(14):4157－4166.

［20］ Steidler L，et al.Treatment of murine colitis by Lactococcus lactis secreting interleukin － 10［J］.Science，2000，289(5483):1352－1355.

［21］ Vandenbroucke K，et al.Active delivery of trefoil factors by genetically modified Lactococcus lactis prevents and heals acute colitis in mice［J］.Gastroenterology，2004，127(2):502 －513.