劉 玲，楊雙華，紀(jì)淑娟，Leif Horsfelt SKIBSTED

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866；2.哥本哈根大學(xué)生命學(xué)部食品系，哥本哈根 2200)

酶聯(lián)免疫吸附結(jié)合熒光分析法測定乳粉加速貯藏過程中的褐變產(chǎn)物

劉 玲1,2，楊雙華1，紀(jì)淑娟1，Leif Horsfelt SKIBSTED2

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866；2.哥本哈根大學(xué)生命學(xué)部食品系，哥本哈根 2200)

在65℃封閉的加速貯藏條件下，對3種不同類型乳粉(全脂乳粉、脫脂乳粉和酪乳粉)的褐變產(chǎn)物——末端糖基化產(chǎn)物(AGEs)進(jìn)行研究和檢測。在確立酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測定末端糖基產(chǎn)物含量的基礎(chǔ)上，結(jié)合熒光分析測定乳粉中蛋白末端糖基化所產(chǎn)生的熒光物質(zhì)。結(jié)果表明：AGEs產(chǎn)生的熒光物質(zhì)和AGEs含量隨著貯藏時(shí)間的延長而增加。酶聯(lián)免疫吸附法采用初級抗體和酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)均為2500倍時(shí)可以有效測定褐變?nèi)榉壑蠥GEs含量，其中加速貯藏20d后乳粉中AGEs含量最高，可達(dá)到0.61ng/mL。最低檢出質(zhì)量濃度達(dá)到0.006ng/mL，最大誤差率在5%左右，重復(fù)性良好。因此，乳粉褐變的熒光強(qiáng)度和AGEs含量的ELISA檢測可以作為評價(jià)乳粉質(zhì)量的有效方法。

乳粉；非酶褐變；末端糖基化產(chǎn)物；酶聯(lián)免疫吸附法；熒光分析

乳粉是一種營養(yǎng)豐富的乳制品，由于其耐貯藏、食用方便，深受人們喜愛。自三聚氰胺事件之后，我國對于乳品安全的監(jiān)管力度日益加強(qiáng)。乳粉在室溫貯存過程中會發(fā)生不同程度的化學(xué)變化，導(dǎo)致營養(yǎng)價(jià)值降低并可能產(chǎn)生有毒物質(zhì)。其中最容易發(fā)生的反應(yīng)之一就是由蛋白質(zhì)、乳糖和脂質(zhì)作用產(chǎn)生的非酶褐變反應(yīng)[1-6]。褐變程度隨著貯藏時(shí)間的延長而加強(qiáng)，因此乳粉的質(zhì)量也隨之不斷下降。褐變的最重要終產(chǎn)物之一是末端糖基化產(chǎn)物(advanced glycosylation end products，AGEs)，它是蛋白質(zhì)在無酶條件下，自發(fā)地與單糖反應(yīng)所產(chǎn)生的多種不同化學(xué)結(jié)構(gòu)交聯(lián)的不穩(wěn)定棕色有熒光特性的混合物[7]。目前，關(guān)于AGEs的研究主要集中在醫(yī)學(xué)方面，在糖尿病并發(fā)癥、動脈粥樣硬化、白內(nèi)障、脊髓側(cè)索硬化癥等病變和衰老的發(fā)展中AGEs均有重要作用。AGEs在人體正常的新陳代謝過程中形成，隨著年齡的增加血液中的AGEs的含量也隨著增加[8-9]。在食品加工貯藏過程中，AGEs往往是因熱處理發(fā)生非酶褐變時(shí)形成，相關(guān)的研究正在引起食品研究工作者的關(guān)注[10-12]。因此，檢測人體內(nèi)中及食品中的AGEs含量對多種疾病的預(yù)防都有重要的意義。AGEs具有多種不同存在形式，目前已知的結(jié)構(gòu)形式包括戊糖苷素(pentosidine)、Versperlysine、羧乙基賴氨酸(CEL)、羧甲基賴氨酸(CML)、咪唑賴氨酸(imidazolysine)、Pyrraline及Crossline等[13-15]。

酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法是近30年發(fā)展起來的一種綜合性酶免疫化學(xué)分析方法，目前已廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)、生物學(xué)和分析化學(xué)等領(lǐng)域，但該方法在我國的食品領(lǐng)域的應(yīng)用主要集中在農(nóng)藥殘留、毒素檢測、病原微生物檢測等方面[16-17]，食品成分檢測應(yīng)用較少，主要原因是食品自身體系較為復(fù)雜。從理論上分析，食品體系的一切物質(zhì)都可直接或間接地作為抗原，因此可以應(yīng)用ELISA分析方法。與傳統(tǒng)的成本高、耗時(shí)費(fèi)力的高效液相色譜和氣相色譜等方法比較，ELISA分析具有簡單、快速、處理樣品量大、靈敏度高且廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)。目前我國用于乳品中的ELISA檢測主要是測定乳中的免疫球蛋白、乳鐵蛋白、農(nóng)殘和毒素，尚未見用于AGEs檢測的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)利用ELISA方法檢測乳粉貯藏過程中產(chǎn)生的AGEs，并結(jié)合AGEs產(chǎn)生的熒光變化來確定乳粉發(fā)生非酶褐變的程度，以期為評定乳粉的質(zhì)量提供一種簡單有效的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳粉于2010年9月28日丹麥Arla乳品公司生產(chǎn)車間采集，采集后取500g密封真空包裝，冷庫(－18℃)保存；使用時(shí)間為2011年11月。

牛血清白蛋白(BSA)、兔抗AGE多克隆抗體、HRP-羊抗兔IgG、明膠 美國Sigma-Aldrich公司；AGE 德國Biologo公司；TMB底物液 丹麥Kem-En-Tec公司；其他試劑均為分析純。

包被液：0.1mol/L碳酸鹽緩沖液，pH9.6；稀釋液：0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)，pH7.4；洗滌液(PBST)：磷酸鹽緩沖液(PBS)＋0.05% Tween-20；封閉液：磷酸鹽緩沖液(PBS)＋0.5%明膠；終止液：0.3mol/L濃硫酸。

1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平 德國Sartorius公司；臺式離心機(jī) 丹麥Ole Dich公司；旋渦混勻器 意大利VELP Scientifica公司；LS5熒光光譜儀 美國Perkin Elmer公司；酶標(biāo)檢測儀 瑞士Tecan公司；96孔酶標(biāo)板 丹麥VWR公司；純凈水制備儀器 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 乳粉的加速貯藏

為誘導(dǎo)乳粉盡快發(fā)生非酶褐變反應(yīng)，將約10g鮮乳粉裝入20mL玻璃瓶并用鋁制蓋密封，放入65℃烘箱貯藏20d，每隔一段時(shí)間取出樣品3瓶進(jìn)行平行測定。樣品有3種類型：全脂乳粉(whole milk powder，WMP)、脫脂乳粉(skimmed milk powder，SMP)和酪乳粉(butter milk pwder，BMP)。

1.3.2 乳粉褐變反應(yīng)產(chǎn)物AGEs波長掃描分析

1.3.2.1 乳粉的前處理

準(zhǔn)確稱取不同貯藏期的1.0mg乳粉定容至10mL純水中，用0.1mol/L鹽酸調(diào)整溶液至pH4.7，稀釋定容至100mL，室溫靜置30min，過濾樣液。

1.3.2.2 波長掃描分析條件

激發(fā)波長347nm；掃描范圍300～500nm；掃描速率200nm/min；λex為5.0nm；λem為5.0nm。

1.3.3 乳粉貯藏過程中AGEs含量的測定

1.3.3.1 乳粉樣品制備

準(zhǔn)確稱取不同貯藏期的2.5mg乳粉定容至5mL磷酸緩沖液(pH9.6)中，渦旋混合器振蕩1h制備成混合液，3000r/min離心10min，留取上清液，得到待測樣品。

1.3.3.2 間接酶聯(lián)免疫吸附法測定

用包被液稀釋抗原，100μL/孔加入待測樣品或抗原(BSA-AGE或BSA)于酶標(biāo)板中，4℃冰箱過夜?；謴?fù)至室溫傾去包被液，加入洗滌液PBST洗板3次，每次2min，洗滌之后將洗滌液除去，扣過來拍打至無殘留液滴出(扣干)。每孔加300μL封閉液，37℃保溫2h，再以PBST洗滌3次，扣干。加100μL/孔經(jīng)過稀釋的初級抗體，于37℃孵育1h。用PBST洗板3次，扣干。再加入100μL/孔經(jīng)過稀釋酶標(biāo)二抗，37℃孵育1h。用PBST洗板3次，扣干。加入TMB顯色液100μL/孔，37℃暗處反應(yīng)15min，顯示藍(lán)色。最后每孔加100μL 0.3mol/L濃硫酸以終止反應(yīng)，顏色變黃。比色檢測波長450nm處測定各孔吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

配制質(zhì)量濃度分別為0.5、0.25、0.125、0.063、0.031、0.016、0.008ng/mL的BSA-AGE標(biāo)準(zhǔn)液，酶聯(lián)免疫測定方法同1.3.3.2節(jié)。以BSA-AGE標(biāo)準(zhǔn)液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 ELISA法測定AGEs含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

以BSA-AGE標(biāo)準(zhǔn)液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，得回歸方程：y＝5.511x＋1.148，R2＝0.994。

制備標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)BSA-AGE的含量確定是在實(shí)驗(yàn)中選擇了3個不同的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度，分別為50、5ng/mL和0.5ng/mL。結(jié)果表明，0.5ng/mL范圍的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性最好。這是由于當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度過高時(shí)，蛋白質(zhì)分子間相互作用力較大，因而影響載體對蛋白質(zhì)的吸附，同時(shí)造成最終顯色過快，沒等全部加入顯色劑都已經(jīng)反應(yīng)完成，使得反應(yīng)不均勻，結(jié)果不準(zhǔn)確。在確定的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，對乳粉樣品進(jìn)行稀釋實(shí)驗(yàn)，得到合適的樣品質(zhì)量濃度。

2.2 初抗和酶標(biāo)二抗質(zhì)量濃度范圍的確定

根據(jù)儀器的檢測范圍，抗原抗體反應(yīng)吸光度在0.5～3.0左右最佳，故選擇吸光度在此范圍內(nèi)的稀釋濃度作為工作范圍。初級抗體的稀釋倍數(shù)為1000～5000，乳粉抗原質(zhì)量濃度為0.05～0.45ng/mL。酶標(biāo)二抗按1:2000、1:4000、1:8000稀釋。3次平行實(shí)驗(yàn)，取平均值，結(jié)果如表1所示?？芍S包被乳粉溶液抗原質(zhì)量濃度升高，反應(yīng)吸光度升高。比較不同的初抗和二抗稀釋度條件，初抗在1:1000～1:3000、酶標(biāo)二抗在1:2000～1:4000的稀釋度條件下，吸光度比較理想，因此選擇稀釋度為初抗1:2500、酶標(biāo)二抗1:2500，在此范圍的質(zhì)量濃度作為工作范圍。

表1 初抗和酶標(biāo)二抗最佳工作質(zhì)量濃度的確定Table1 Selection of optimal concentration of antibody and HRP labeled goat anti-rabbit IgG

2.3 乳粉中AGEs的波長掃描圖譜分析

圖1 全脂乳粉AGEs物質(zhì)波長掃描譜圖Fig.1 Scanning spectra of AGEs in whole milk powder stored for different days

從圖1可看出，隨著貯藏時(shí)間的延長，全脂乳粉的熒光強(qiáng)度呈增強(qiáng)趨勢。在415nm波長處，熒光強(qiáng)度從22.47上升到98.84。熒光強(qiáng)度的上升說明熒光物質(zhì)的含量隨著乳粉貯藏時(shí)間的延長而提高。這些熒光物質(zhì)當(dāng)中，主要為美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物，也有部分脂質(zhì)氧化產(chǎn)物和其他熒光物質(zhì)[18-19]，熒光強(qiáng)度的增強(qiáng)說明美拉德反應(yīng)主導(dǎo)物質(zhì)AGEs大量累積。同時(shí)，隨著貯藏時(shí)間的延長，譜峰的位置低波長方向遷移，說明其熒光物質(zhì)的結(jié)構(gòu)逐漸發(fā)生細(xì)微變化，因?yàn)锳GEs是一系列交聯(lián)聚合物質(zhì)，隨著高溫貯藏時(shí)間的延長，美拉德反應(yīng)生成的AGEs的結(jié)構(gòu)會有一定變化。

2.4 3種乳粉AGEs熒光物質(zhì)的對比分析

圖2 貯藏過程中3種乳粉熒光產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度變化Fig.2 Changes in fluorescent intensity of three types of milk powder during accelerated storage

從圖2可以看出，3種乳粉的熒光強(qiáng)度都在貯藏過程中有比較明顯的增加。其中全脂乳粉(WMP)和脫脂乳粉(SMP)在65℃的貯藏條件下AGEs物質(zhì)的生成速度基本一致，在前10d，脫脂乳粉略快于全脂乳粉，但10d之后全脂乳粉加速反應(yīng)超越脫脂乳粉，最后兩者終產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度基本持平。但是，酪乳粉(BMP)在貯藏過程中體現(xiàn)出特殊的反應(yīng)速度，在貯藏之初就有一定的熒光物質(zhì)，在20d的貯藏過程中AGEs熒光物質(zhì)生成速度相對不高。最后酪乳粉的熒光強(qiáng)度與其他兩種乳粉基本接近，3種乳粉最終產(chǎn)生的熒光物質(zhì)含量相當(dāng)。酪乳粉的這種變化主要是因?yàn)槠浼庸み^程比較特殊，它是攪拌脫去黃油后干燥制得，蛋白質(zhì)含量相對稍高，在脫黃油加工過程中可能部分成分已經(jīng)開始反應(yīng)形成熒光物質(zhì)，而隨著蛋白質(zhì)的變性，在貯藏過程中可以進(jìn)一步生成AGEs熒光物質(zhì)的成分就減少，最終反應(yīng)產(chǎn)物沒有量的優(yōu)勢。另一方面也說明，除了AGEs產(chǎn)生熒光物質(zhì)之外，有其他熒光物質(zhì)在此波長條件下存在，比如脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的終產(chǎn)物及乳糖所產(chǎn)生的熒光物質(zhì)等[18-19]。由此可見，熒光分析可以用于評價(jià)貯藏終產(chǎn)物的增長趨勢，但是直接從熒光物質(zhì)的測定來確定非酶褐變可能會存在一定的偏差，因此結(jié)合AGEs含量的測定來確定褐變程度更為準(zhǔn)確。

2.5 乳粉中AGEs含量的測定

圖3 加速貯藏過程中3種乳粉AGEs含量的變化Fig.3 Changes in the contents of AGEs in three types of milk powder during accelerated storage

由圖3可知，3種乳粉在加速貯藏過程中，其AGEs含量均呈上升趨勢，新鮮乳粉中AGEs的含量經(jīng)檢測為0.006ng/mL，接近0，加速貯藏20d后的AGEs含量上升至0.14～0.61ng/mL，其中全脂乳粉的AGEs生成量最大，反應(yīng)速度最快，在16d時(shí)反應(yīng)誤差較大，達(dá)到5%，其他階段反應(yīng)誤差在1%～2%之間，重復(fù)性良好。在貯藏前5～10d，全脂乳粉中AGEs生成速度增長得很快，之后速度減慢，最后3天又大幅度增加，這一現(xiàn)象與感官檢測到的乳粉的顏色改變基本一致，說明在加速貯藏到一周之后，乳粉已經(jīng)大比例發(fā)生非酶褐變的美拉德反應(yīng)，多數(shù)蛋白質(zhì)和乳糖、甚至部分脂質(zhì)都參與了美拉德反應(yīng)。這種主要成分的參與也改變了乳粉的營養(yǎng)價(jià)值。

3種乳粉中，全脂乳粉含有較高含量的脂肪(約26%)，脫脂乳粉和酪乳粉都含低于5%的脂肪；酪乳粉的蛋白質(zhì)含量略高于全脂乳粉和脫脂乳粉，但差別不大。由圖3可知，全脂乳粉形成AGEs的速度最快，可見脂質(zhì)的存在是形成AGEs的重要條件。脂質(zhì)氧化和美拉德反應(yīng)依附存在[20]，脂質(zhì)的氧化加速了美拉德反應(yīng)的速度，導(dǎo)致AGEs反應(yīng)加速。而脂質(zhì)氧化和美拉德反應(yīng)造成食品營養(yǎng)成分的大量損失，在人體內(nèi)則會誘發(fā)各種老年性疾病。因此，通過研究檢測AGEs的含量變化不僅可以應(yīng)用在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中老年性疾病的鑒定，也可以應(yīng)用于食品劣變的質(zhì)量評價(jià)。

3 結(jié) 論

本研究通過建立ELISA方法鑒定美拉德褐變產(chǎn)物AGEs的含量，配合糖基化產(chǎn)物熒光物質(zhì)的含量檢測來確定乳粉加速貯藏過程中非酶褐變物質(zhì)的含量，從而確定乳粉化學(xué)劣變的程度。通過實(shí)驗(yàn)，隨著貯藏時(shí)間延長褐變產(chǎn)物含量增加，乳粉劣變加速。采用ELISA方法鑒定AGEs的含量，具有特異性強(qiáng)、簡便、高效的優(yōu)勢。在本實(shí)驗(yàn)中，標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低質(zhì)量濃度取值0.008ng/mL，最低檢出質(zhì)量濃度達(dá)到0.006ng/mL，誤差率在5%左右，重復(fù)性良好。采用ELISA方法可以同時(shí)做多個樣品，具有處理量大節(jié)約時(shí)間的優(yōu)點(diǎn)。ELISA方法結(jié)合糖基化產(chǎn)物的熒光物質(zhì)檢測鑒定AGEs含量，為乳粉貯藏過程中的劣變化學(xué)反應(yīng)檢測提供了一種簡便準(zhǔn)確的方法。

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Determination ELISA Coupled with Fluorescence Spectroscopy of Browning Products of Milk Powder during Accelerated Storage

LIU Ling1,2，YANG Shuang-hua1，JI Shu-juan1，Leif Horsfelt SKIBSTED2
(1. College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China；2. Department of Food Science, Faculty of Life Sciences, University of Copenhagen, Copenhagen 2200, Denmark)

This study aimed to determine the browning products—advanced glycation end products (AGEs) in milk powder stored under accelerated conditions at 65 ℃ for 20 days by ELISA coupled with fluorescence spectroscopy. Results indicated that higher amounts of AGEs and fluorescent compounds were formed with prolonged storage time. ELISA could effectively determine the content of AGEs in milk powder when the concentration of both primary antibody and HRP-labeled secondary antibody was diluted to 2500 times. The highest content of AGEs in whole milk powder was observed, reaching 0.61 ng/mL, after 20 days of storage, and the minimum detected concentration was 0.006 g/mL. The maximum relative error was around 5% and good repeatability was found. Therefore, fluorescence intensity and the level of AGEs could be applied to evaluate the quality of milk powder.

milk powder；browning products；advanced glycation products；enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)；fluorescence analysis

TS201.2

A

1002-6630(2013)18-0249-04

10.7506/spkx1002-6630-201318051

2012-08-28

劉玲(1973—)，女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與分析。E-mail：liuling4568@sina.com