崔 誠(chéng)，陳 悅，陳季旺,*，夏文水,2

(1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122)

基于混合床離子交換樹(shù)脂脫鹽的草魚(yú)肽及其理化性質(zhì)

崔 誠(chéng)1，陳 悅1，陳季旺1,*，夏文水1,2

(1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122)

研究混合床離子交換樹(shù)脂對(duì)草魚(yú)肽的脫鹽工藝條件，并分析脫鹽后草魚(yú)肽的理化性質(zhì)。結(jié)果表明：脫鹽的較佳工藝條件為上樣質(zhì)量濃度10mg/mL、流速6BV/h、pH7.0、陰陽(yáng)離子樹(shù)脂混合比例為2:3。在該工藝條件下，脫鹽率達(dá)到81.7%，肽回收率為80.5%，草魚(yú)肽灰分從17.5%降低到3.2%，肽含量從80.9%增加到90.3%。脫鹽后草魚(yú)肽的相對(duì)分子質(zhì)量分布范圍主要集中在190～1000之間，含量達(dá)到了91.5%；溶解度在pH2～10范圍內(nèi)均大于95%，溶液質(zhì)量濃度達(dá)到40g/100mL時(shí)，其黏度只有4.5mPa·s，具有高質(zhì)量濃度、低黏度的特點(diǎn)。

草魚(yú)肽；混合床離子交換樹(shù)脂；理化性質(zhì)

魚(yú)源寡肽是利用蛋白酶特異性水解魚(yú)類蛋白質(zhì)產(chǎn)生的一類相對(duì)分子質(zhì)量在200～10000之間的肽類物質(zhì)。魚(yú)源寡肽不僅具有魚(yú)源蛋白質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)還具有良好的溶解性、熱穩(wěn)定性等理化性質(zhì)以及易消化吸收等生理功能。目前，研究酶水解法制備寡肽成為魚(yú)類加工中的一個(gè)前沿課題[1-3]。草魚(yú)是7種大宗淡水魚(yú)類之一，食性簡(jiǎn)單，餌料來(lái)源廣泛，肉質(zhì)肥嫩，味鮮美，且生長(zhǎng)迅速，產(chǎn)量高。2010年，我國(guó)7種大宗淡水魚(yú)的總產(chǎn)量為1623.4萬(wàn)t，草魚(yú)產(chǎn)量占淡水魚(yú)總產(chǎn)量的18%。因此，草魚(yú)是一種良好的制備魚(yú)源寡肽的原料來(lái)源[4]。

在酶解魚(yú)源蛋白質(zhì)生產(chǎn)寡肽的過(guò)程中，需不斷地加入堿液中和酶解蛋白質(zhì)產(chǎn)生的H+維持反應(yīng)體系的pH值恒定，魚(yú)源寡肽的鹽分含量較高，主要為NaCl。這些鹽分的存在影響了魚(yú)源寡肽的風(fēng)味、理化性質(zhì)和生物活性，需要進(jìn)行脫鹽處理[5-6]。目前生物活性物質(zhì)的脫鹽方法主要有透析、超濾和納濾等，但是這些方法對(duì)小分子物質(zhì)脫鹽效果不佳或無(wú)法實(shí)現(xiàn)[7-10]。盡管大孔吸附樹(shù)脂用于小分子物質(zhì)的脫鹽具有選擇性好、再生處理方便、吸附迅速以及解吸容易、對(duì)脫鹽原料理化性質(zhì)影響小等特點(diǎn)，但是由于其只吸附疏水性高的小分子物質(zhì)，回收率不高，且我國(guó)對(duì)大孔吸附樹(shù)脂在保健食品及其原料生產(chǎn)過(guò)程有嚴(yán)格的限制[11-14]。

離子交換樹(shù)脂由于交換容量高、交換速度快、吸附容量大、選擇性好、易于解吸附、化學(xué)性能穩(wěn)定、不溶于酸、堿及任何有機(jī)溶劑等，常用于去除水中各種陰陽(yáng)離子和氨基酸的分離[15-17]。傳統(tǒng)的離子交換樹(shù)脂脫鹽采用分別通過(guò)陰陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，脫鹽過(guò)程繁瑣，并且由于離子交換過(guò)程中會(huì)使體系的pH值不穩(wěn)定，導(dǎo)致許多寡肽分子在溶液中帶有電荷，造成了寡肽的損失[17]?；旌洗搽x子交換樹(shù)脂脫鹽過(guò)程中，體系pH值比較穩(wěn)定以及陰陽(yáng)離子的相互作用都會(huì)大大減少寡肽的損失[18]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究混合床離子交換樹(shù)脂對(duì)酶解制備草魚(yú)肽的脫鹽效果，確定其較佳脫鹽工藝條件，并分析脫鹽后草魚(yú)肽的理化性質(zhì)，為草魚(yú)肽的工業(yè)化生產(chǎn)以及后續(xù)結(jié)構(gòu)與生化性質(zhì)關(guān)系分析提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮草魚(yú) 武漢市購(gòu)。

001×16(Na)型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂、D301-G(Cl)型陰離子交換樹(shù)脂 江蘇蘇青水處理工程集團(tuán)有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Delta320精密pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；DDS-11C電導(dǎo)率儀 上海雷磁儀器廠；LD5-10型離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠；LG-3型冷凍干燥機(jī) 寧波市生化儀器廠；HL-2S恒流泵 上海滬西分析儀器廠；UV-2100紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海尤尼柯儀器有限公司；TGL-16C高速離心機(jī) 上海安亭儀器有限公司；NDJ-79型旋轉(zhuǎn)黏度計(jì) 上海昌吉地質(zhì)儀器有限公司；超濾裝置(聚砜中空纖維超濾膜，膜面積為0.1m2，尺寸為Ф40mm×300mm，截留相對(duì)分子質(zhì)量10000) 上海亞?wèn)|核級(jí)樹(shù)脂有限公司；600高效液相色譜儀(配2487紫外檢測(cè)器和Empower工作站) 美國(guó)Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 原料成分分析

蛋白質(zhì)含量的測(cè)定：采用微量凱氏定氮法(GB/T 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》)，轉(zhuǎn)換系數(shù)F=6.25；水分的測(cè)定：采用105℃恒質(zhì)量法(GB/T 5009.3—2010《食品中水分的測(cè)定》)；灰分的測(cè)定：采用550～600℃灰化法(GB/T 5009.4—2010《食品中灰分的測(cè)定》)；肽含量測(cè)定：參考GB/T 22729—2008《海洋魚(yú)低聚肽粉》。

1.3.2 草魚(yú)肽的制備

草魚(yú)肉經(jīng)絞碎勻漿，配成30g/100mL的溶液，調(diào)pH9.0，在50℃條件下，按48AU/kg的酶與底物比加入一定量的堿性蛋白酶酶解2h，然后調(diào)pH7.0，按2:1的比例添加一定量的中性蛋白酶酶解30min，酶解完成后調(diào)pH5.5滅酶15min，3000r/min離心20min，收集上清液調(diào)節(jié)pH7.0進(jìn)行超濾，真空濃縮，冷凍干燥得到草魚(yú)肽。

1.3.3 超濾預(yù)處理

在室溫條件下，操作壓力為0.1MPa，將50mg/mL的草魚(yú)肽溶液注入儲(chǔ)槽中，在泵的推動(dòng)力下，溶液經(jīng)微濾后進(jìn)入超濾膜中。從中空纖維膜的內(nèi)壁滲透出來(lái)的小分子寡肽是超濾液，溶液中的大分子多肽等被截留濃縮，返回到儲(chǔ)槽中；如此反復(fù)循環(huán)，收集超濾液[19]。

1.3.4 混合床離子交換樹(shù)脂脫鹽

1.3.4.1 不同流速對(duì)草魚(yú)肽脫鹽效果的影響

在室溫條件下，將10mg/mL的草魚(yú)肽溶液pH值調(diào)為7.0，分別以1、2、4、6、8BV/h的流速通過(guò)陰、陽(yáng)離子按3:2的比例組成的混合床進(jìn)行脫鹽，收集流出液，測(cè)定電導(dǎo)率和肽含量，按式(1)、(2)計(jì)算電導(dǎo)率變化率和肽回收率，確定較佳的流速。

1.3.4.2 pH值對(duì)脫鹽效果的影響

在室溫條件下，將10mg/mL的草魚(yú)肽溶液pH值分別調(diào)為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，以較佳的流速通過(guò)陰、陽(yáng)離子按3:2的比例組成的混合床進(jìn)行脫鹽，收集流出液，測(cè)定電導(dǎo)率和肽含量，并計(jì)算肽回收率和電導(dǎo)率變化率，確定較佳的pH值。

1.3.4.3 陰陽(yáng)離子交換樹(shù)脂比例對(duì)脫鹽效果的影響

在室溫條件下，將10mg/mL的肽溶液調(diào)為較佳的pH值，以較佳的流速通過(guò)陰、陽(yáng)離子按1:2、2:3、1:1、3:2、2:1比例組成的混合床進(jìn)行脫鹽，收集流出液，測(cè)定電導(dǎo)率和肽含量，并計(jì)算肽回收率和電導(dǎo)率變化率，確定較佳的樹(shù)脂比例。

1.3.5 溶解性的測(cè)定

將2g草魚(yú)肽加入100mL水中，用1.0mol/L鹽酸和1.0mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH2～10，室溫條件下1000r/min攪拌1h，3000r/min離心20min，測(cè)上清液中肽含量[19]，溶解度按公式(3)計(jì)算。

1.3.6 黏度的測(cè)定

在室溫條件下，將草魚(yú)肽配制成5、10、20、30g/100mL和40g/100mL，pH7.0的溶液，測(cè)定溶液的表觀黏度。對(duì)比草魚(yú)蛋白和草魚(yú)肽的黏度，分析黏度的變化[19]。

1.3.7 相對(duì)分子質(zhì)量分布測(cè)定

高效液相色譜儀：Waters 600/2487；色譜柱：TSKgel G2000 SWXL 300mm×7.8mm；流動(dòng)相：乙腈-水-三氟乙酸(45:55:0.1，V/V)；檢測(cè)波長(zhǎng)：220nm；柱溫：30℃；流速：0.5mL/min。相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品：細(xì)胞色素C(Mr12500)、抑肽酶(Mr6500)、桿菌酶(Mr1450)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(Mr451)和乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(Mr189)[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 混合床離子交換樹(shù)脂脫鹽

2.1.1 不同流速對(duì)草魚(yú)肽脫鹽效果的影響

圖1 不同流速條件下草魚(yú)肽的肽回收率和電導(dǎo)率變化率Fig.1 Effect of sample loading flow rate on peptide recovery and conductivity

從圖1可以看出，隨著流速的增加，脫鹽后的草魚(yú)肽溶液電導(dǎo)率變化率不斷減小，肽回收率不斷增加。當(dāng)流速?gòu)?BV/h增加到8BV/h時(shí)，脫鹽后草魚(yú)肽溶液的電導(dǎo)率從107.3μS/cm增加到292μS/cm，電導(dǎo)率變化率從96.6%降低到88.9%，肽回收率從58.6%增加到78.2%。這可能是由于流速過(guò)快時(shí)，草魚(yú)肽溶液與樹(shù)脂接觸時(shí)間很短，脫鹽率降低；流速較慢時(shí)，草魚(yú)肽溶液與樹(shù)脂接觸時(shí)間很長(zhǎng)，樹(shù)脂對(duì)溶液中的草魚(yú)肽分子吸附程度增加，造成了肽的損失較大，肽回收率較低[18]。綜合考慮，選擇流速為6BV/h，此時(shí)的電導(dǎo)率變化率為93.2%，肽回收率為77.2%。

2.1.2 pH值對(duì)草魚(yú)肽脫鹽效果的影響

圖2 不同pH值條件下草魚(yú)肽的肽回收率和電導(dǎo)率變化率Fig.2 Effect of pH on peptide recovery and conductivity

從圖2可以看出，pH值對(duì)肽回收率影響較大，對(duì)電導(dǎo)率變化率的影響不明顯。pH5～7范圍內(nèi)，脫鹽后的草魚(yú)肽溶液電導(dǎo)率從170.6μS/cm增加到173.3μS/cm，電導(dǎo)率變化率從94.6%降低到93.7%，肽回收率從72.2%增加到77.2%；pH7～9范圍內(nèi)，脫鹽后的草魚(yú)肽溶液電導(dǎo)率從173.3μS/cm增加到347.0μS/cm，電導(dǎo)率變化率從93.7%降低到89.8%，肽回收率從77.2%降低到67.7%。這可能是由于溶液的pH值會(huì)影響到體系的離子化程度，當(dāng)pH值偏小或偏大時(shí)，溶液的離子化程度較大，樹(shù)脂對(duì)溶液中的草魚(yú)肽分子吸附程度增加，肽損失較多[18]。綜合考慮，選擇pH7.0為較佳的pH值，此時(shí)的電導(dǎo)率變化率為93.7%，肽回收率為77.2%。

2.1.3 陰、陽(yáng)離子交換樹(shù)脂比例對(duì)草魚(yú)肽脫鹽效果的影響

圖3 不同樹(shù)脂比例條件下草魚(yú)肽的肽回收率和電導(dǎo)率變化率Fig.3 Effect of anion/cation exchange resin ratio on peptide recovery and conductivity

陰、陽(yáng)離子樹(shù)脂混合比例對(duì)草魚(yú)肽脫鹽效果的影響見(jiàn)圖3?？梢钥闯觯?、陽(yáng)離子樹(shù)脂混合比例在1:2～2:3范圍，脫鹽后草魚(yú)肽溶液電導(dǎo)率從529.0μS/cm降低到191.1μS/cm，電導(dǎo)率變化率從78.3%增加到91.8%，肽回收率從86.7%降低到79.7%；陰、陽(yáng)離子樹(shù)脂混合比例在2:3～2:1范圍，脫鹽后草魚(yú)肽溶液電導(dǎo)率變化率基本不變，肽回收率從79.7%降低到75.2%。這可能是由于大孔型離子交換樹(shù)脂有較多的物理孔隙，吸附能力強(qiáng)，而凝膠型離子交換樹(shù)脂吸附能力相對(duì)較弱。實(shí)驗(yàn)中的D301-G型陰離子樹(shù)脂是大孔型離子交換樹(shù)脂，001×16型陽(yáng)離子樹(shù)脂是凝膠型離子交換樹(shù)脂，隨著混合床中陰離子樹(shù)脂所占比例的增加，體系對(duì)草魚(yú)肽的吸附能力也不斷增加，造成了肽的損失，同時(shí)陰、陽(yáng)離子比例混合不當(dāng)也會(huì)使脫鹽過(guò)程中體系pH值發(fā)生比較明顯的變化，從而造成寡肽的損失[18]。綜合考慮，選擇陰、陽(yáng)離子樹(shù)脂混合比例為2:3。

2.1.4 混合床陰陽(yáng)離子交換樹(shù)脂脫鹽前后草魚(yú)肽的成分

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定草魚(yú)肽脫鹽的較佳工藝條件為上樣質(zhì)量濃度10mg/mL、流速6BV/h、pH7.0、陰、陽(yáng)離子樹(shù)脂混合比例為2:3。在該工藝條件下對(duì)草魚(yú)肽進(jìn)行脫鹽，收集的脫鹽液經(jīng)真空濃縮和冷凍干燥后得到草魚(yú)肽，脫鹽率為81.7%，肽回收率為80.5%，其成分分析結(jié)果見(jiàn)表1。脫鹽后的草魚(yú)肽肽含量明顯增加，從80.9%增加到90.3%，灰分含量明顯降低，從17.5%降低到3.2%，脫鹽效果良好。

表1 草魚(yú)肽脫鹽前后的成分Table1 The components of grass carp peptides between desalination and undesalination

2.2 草魚(yú)肽和草魚(yú)蛋白的溶解性

圖4 草魚(yú)蛋白和草魚(yú)肽在不同pH值時(shí)的溶解性Fig.4 Comparison of the effect of different desalination techniques on components of GCPs

對(duì)草魚(yú)蛋白和草魚(yú)肽在pH2～10范圍內(nèi)的溶解度進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖4。在pH2～10范圍，脫鹽后草魚(yú)肽的溶解度明顯高于草魚(yú)蛋白。當(dāng)在pH2～4范圍，草魚(yú)蛋白的溶解度由61.5%下降到17.7%；pH4～10范圍，其溶解度由17.7%增加到60.8%。草魚(yú)肽在pH2～10范圍內(nèi)，溶解度基本上沒(méi)變化，并且均大于95%?？赡苁遣蒴~(yú)蛋白酶解后，極性基團(tuán)(—COOH和—NH2)增加，分子表面電荷增多，加強(qiáng)了分子與水溶液之間的靜電作用。由于草魚(yú)肽具有良好的溶解性，且不受pH值的影響，因此適用于酸性和高蛋白飲品。

2.3 草魚(yú)肽和草魚(yú)蛋白溶液的黏度

圖5 不同質(zhì)量濃度草魚(yú)肽和草魚(yú)蛋白的黏度Fig.5 Effect of peptide concentration on the viscosity of GCPs

不同質(zhì)量濃度草魚(yú)肽和草魚(yú)蛋白的黏度變化見(jiàn)圖5。在不同質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，脫鹽后草魚(yú)肽的黏度明顯低于草魚(yú)蛋白?？赡苁遣蒴~(yú)蛋白經(jīng)酶解后，分子質(zhì)量和分子體積減小，使得分子的有序性增加，導(dǎo)致黏度下降。草魚(yú)肽的黏度隨著質(zhì)量濃度的增加而逐漸增大，在5～20g/100mL的低質(zhì)量濃度范圍，黏度很小且變化緩慢，從1.1mPa·s增加到1.8mPa·s。在20～40g/100mL的高質(zhì)量濃度范圍，黏度變化較快，從1.8mPa·s增加到4.5mPa·s。草魚(yú)肽溶液質(zhì)量濃度達(dá)到40g/100mL，其黏度只有4.5mPa·s，說(shuō)明草魚(yú)肽具有高質(zhì)量濃度、低黏度的特點(diǎn)，適用于高蛋白流體食品。

2.4 草魚(yú)肽和草魚(yú)蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量分布

圖6 草魚(yú)蛋白、脫鹽前后草魚(yú)肽的相對(duì)分子質(zhì)量分布Fig.6 HPLC patterns of grass carp protein, GCPs and desalinated GCPs

表2 草魚(yú)蛋白、脫鹽前后草魚(yú)肽的相對(duì)分子質(zhì)量分布Table2 Relative molecular mass distribution of grass carp protein, GCPs and desalinated GCPs

草魚(yú)蛋白、脫鹽前草魚(yú)肽和脫鹽后草魚(yú)肽的相對(duì)分子質(zhì)量分布結(jié)果見(jiàn)圖6和表2。草魚(yú)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量分布范圍較廣，相對(duì)分子質(zhì)量大于1500的肽組分含量高達(dá)77.4%；酶解制備的草魚(yú)肽相對(duì)分子質(zhì)量明顯降低且分布范圍較窄，主要集中在190～1000之間；脫鹽前后的草魚(yú)肽相對(duì)分子質(zhì)量分布基本沒(méi)有變化，只是相對(duì)分子質(zhì)量1000以上組分的含量從6.5%降低到4.5%，說(shuō)明在精制脫鹽過(guò)程中，損失了一定量的大分子多肽，小分子寡肽含量基本沒(méi)有損失。脫鹽后草魚(yú)肽相對(duì)分子質(zhì)量在1000以上和190以下組分的含量較低，分別為4.5%和4.0%；其次為相對(duì)分子質(zhì)量在500～1000之間的組分，含量為32.3%；相對(duì)分子質(zhì)量在190～500之間的組分含量最高，為59.2%。說(shuō)明草魚(yú)肽主要是由一些相對(duì)分子質(zhì)量較低的寡肽組成。

3 結(jié) 論

3.1 混合床離子交換樹(shù)脂對(duì)草魚(yú)肽脫鹽的較佳工藝條件為：上樣質(zhì)量濃度10mg/mL、流速6BV/h、pH7.0、陰陽(yáng)離子樹(shù)脂混合比例為2:3。在該工藝條件下脫鹽率達(dá)到81.7%，肽回收率為80.5%。脫鹽后的肽含量從超濾后的80.9%增加到90.3%，灰分從17.5%降低到3.2%，說(shuō)明混合床離子交換樹(shù)脂能較好的脫去草魚(yú)肽中的鹽，且小分子寡肽損失較少，可用于草魚(yú)肽的工業(yè)化脫鹽精制。

3.2 脫鹽后草魚(yú)肽的相對(duì)分子質(zhì)量分布范圍主要集中在190～1000之間，含量達(dá)到了91.5%；草魚(yú)肽的溶解度在pH2～10范圍內(nèi)均大于95%以上，適用于酸性和高蛋白飲品；草魚(yú)肽具有高質(zhì)量濃度、低黏度的特點(diǎn)，適用于高蛋白流體食品。

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Desalination Using Mixed-Bed Ion Exchange Resin and Physiochemical Properties of Grass Carp Peptides

CUI Chen1，CHEN Yue1，CHEN Ji-wang1,*，XIA Wen-shui1,2
(1. College of Food Science and Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China；2. School of Food Science and Technology, Jiangnan Unviersity, Wuxi 214122, China)

In the present study, we investigated the process conditions for desalinating grass carp peptides (GCPs) using mixed-bed ion exchange resin and characterized desalinated GCPs. The optimal desalination conditions for GCPs were sample concentration of 10 mg/mL, loading flow rate of 6 BV/h, pH 7.0 and anion/cation exchange resin ratio of 2:3. Under these conditions, the desalination rate was 81.7% and the peptide recovery was 80.5%; meanwhile, the ash content in GCPs was reduced from 17.5% to 3.2%, and the peptide content was increased from 80.9% to 90.3%. The relative molecular mass of desalinated GCPs was mostly distributed in the range of 190 to 1000 in an amount of 91.5%, solubility was greater than 95% in the pH range of 2 to 10, and viscosity was only 4.5 mPa?s at the concentration of 40 g/100 mL.

grass carp peptides；mixed-bed ion exchange resin；physiochemical properties

TS254.9

A

1002-6630(2013)18-0023-05

10.7506/spkx1002-6630-201318005

2012-08-21

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-46)；國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2010AA023003)；武漢工業(yè)學(xué)院研究生創(chuàng)新基金項(xiàng)目(2010CX014)

崔誠(chéng)(1988—)，男，碩士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品加工及貯藏工程。E-mail：Cuicheng.2008@163.com

*通信作者：陳季旺(1970—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品加工及貯藏工程。E-mail：jiwangchen1970@126.com