吳維光，葛紅雨，韓建秋

（武警后勤學院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，天津 300162）

·論 著·

DEHP體外影響大鼠睪丸間質(zhì)細胞Bax和Bcl-2基因表達的實驗研究

吳維光，葛紅雨，韓建秋

（武警后勤學院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，天津 300162）

目的通過對原代培養(yǎng)的大鼠睪丸間質(zhì)細胞進行鄰苯二甲酸二乙基己酯（di-2-ethylhexyl phthalate，DEHP）染毒，探討DEHP體外對大鼠睪丸間質(zhì)細胞Bax和Bcl-2基因表達及凋亡的影響。方法體外分離和原代培養(yǎng)未成熟大鼠睪丸間質(zhì)細胞，用不同濃度的DEHP（10、50、100nmol/L）染毒24h。熒光定量PCR法檢測間質(zhì)細胞Bax和Bcl-2基因mRNA表達，Weastern blot檢測間質(zhì)細胞Bax和Bcl-2蛋白表達，流式細胞術檢測間質(zhì)細胞凋亡率。結果與對照組相比，DEHP各組睪丸間質(zhì)細胞Bcl-2基因mRNA和蛋白表達下降（P＜0.05），Bax基因mRNA和蛋白表達增加（P＜0.05），細胞凋亡率增加（P＜0.05），呈濃度依賴關系。結論DEHP可通過抑制Bcl-2基因表達和上調(diào)Bax基因表達誘導大鼠睪丸間質(zhì)細胞凋亡，進而影響間質(zhì)細胞功能。

鄰苯二甲酸二乙基己酯；睪丸；間質(zhì)細胞；大鼠

鄰苯二甲酸酯（phthalates，PAEs）是一類人工合成有機化合物，可作為農(nóng)藥載體、驅蟲劑、化妝品、香味品、潤滑劑和去泡沫劑等生產(chǎn)原料，也是塑料產(chǎn)品生產(chǎn)中的添加劑。因其與塑料基質(zhì)之間不形成共價鍵，而是以氫鍵和范德華力連接，故易從塑料中溶出而污染環(huán)境。在許多地方的大氣、水體、土壤以及動物體內(nèi)都可檢測到PAEs［1］，在人體的血液、尿液、精液、羊水、母乳中也能檢測到PAEs及其代謝產(chǎn)物［2-3］。在眾多的PAEs種類中，鄰苯二甲酸二乙基己酯（di-2-ethylhexyl phthalate，DEHP）用量最大，約占PAEs總量的50％。DEHP進入人體后可引起肝、腎、肺、心、生殖系統(tǒng)等臟器毒性損害，其中對雄性生殖系統(tǒng)的毒性損害已得到廣泛的關注。睪丸中間質(zhì)細胞是DEHP作用的靶細胞之一，其可通過影響間質(zhì)細胞的結構和功能，進而影響生精過程。目前DEHP損傷間質(zhì)細胞的機制還不十分清楚，本研究通過觀察DEHP對體外培養(yǎng)的大鼠睪丸間質(zhì)細胞Bax和Bcl-2基因表達作用以及對細胞凋亡的影響，探討DEHP對睪丸間質(zhì)細胞凋亡的誘導作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要試劑：18～21日齡雄性SD大鼠10只，由天津醫(yī)科大學實驗動物中心提供。DMEM/F12培養(yǎng)基購于Gibico公司，Ⅰ型膠原酶、DEHP購于Sigma公司，F(xiàn)ITC/PI雙標凋亡試劑盒購于Invitrogen公司，Percoll分離液購于Pharmacia公司，Real-time PCRMaster Mix購于TaKaRa公司，Bax和Bcl-2兔抗鼠抗體購于Santa cruz公司，寡核苷酸引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 間質(zhì)細胞的分離與培養(yǎng)：取雄性SD大鼠，斷頸處死，無菌條件下取出睪丸，剝除較大血管，加入少許PBS（0.01mol/L，pH7.4）清洗后置離心管中，加入0.5g/L的Ⅰ型膠原酶，34℃振蕩消化20min左右，待睪丸組織形成糊狀剛好消失，但是生精小管連續(xù)而無斷裂時，加入等體積的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化。細胞懸液過200目鋼篩，濾液800r/min離心5min，棄上清，DMEM/F12培養(yǎng)液重新懸浮細胞，800r/min離心5min，棄上清，加入含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，制成細胞懸液。加入預制冷的Percoll密度梯度離心液（梯度自上而下分別為30％、40％、50％、60％），800r/min低速離心30min，吸出第2條帶細胞于離心管中，加入2倍體積的DMEM/F12培養(yǎng)液，1 000r/min離心5min，棄上清，加入DMEM/F12培養(yǎng)液，調(diào)整密度至106/mL，并接種于培養(yǎng)板中，于34℃、5％CO2條件下培養(yǎng)。通過3β-羥類固醇脫氫酶（3 beta-hydroxy steroid dehydrogenase，3β-HSD）免疫細胞化學法鑒定睪丸間質(zhì)細胞的純度約80％。

1.3 DEHP對間質(zhì)細胞的毒性實驗：將間質(zhì)細胞接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)24 h后，換含DEHP的培養(yǎng)液，終濃度分別分10、50、100nmol/L，以只加DMSO的細胞作為對照，分別命名為DMSO對照組、DEHP低劑量組、DMHP中劑量組、DEHP高劑量組，細胞繼續(xù)培養(yǎng)24h。

1.4 熒光定量PCR法檢測Bax和Bcl-2基因mRNA：細胞總RNA和逆轉錄成cDNA按試劑盒說明進行，產(chǎn)物-20℃保存。采用7700全定量PCR儀（Applied Biosystems），以β-actin為內(nèi)參照進行PCR。Bax基因引物序列，上游，5'-AGCGGCTGCTTGTCTGGAT-3'，下游，5'-TGAGGACTCCAGCCACAAAGA-3'；Bcl-2引物序列，上游，5'-TTCTCTCGTCGCTACCGTCG-3'，下游，5'-CCCTGAAGAGTTCCTCCACCA-3'。β-actin引物序列，上游，5'-ATTGCCGACAGGATGCAGAA-3'，下游，5'-ACATCTGCTGGAAGGTGGACA-3'。反應條件，95℃1min，95℃15s，60℃15s、72℃45s，共40個循環(huán)。計算目的基因相對表達量相對定量（relative quantification，RQ）值。

1.5 免疫蛋白印跡檢測Bax和Bcl-2蛋白：裂解緩沖液提取細胞總蛋白，蛋白定量后取30μg總蛋白進行SDS-PAGE電泳，將電泳后分離的蛋白電轉至硝酸纖維素膜上，5％脫脂奶封閉，分別加Bax或Bcl-2兔抗鼠抗體，4℃過夜，TBST（tris-buffered saline-tween 20）洗3次，每次15min。再加入辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG，室溫下反應1.5h，0.1％含tween的TBST洗膜，增強化學發(fā)光壓片顯色，掃描并分析圖像。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡率：操作按異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）/碘化丙啶（peropidium iodide，PI）-annexin V凋亡試劑盒說明書進行。各組細胞用4℃預冷的PBS洗滌細胞2次，250μL結合緩沖液重懸細胞，調(diào)整濃度為5× 106/mL。取100μL細胞懸液于5mL流式管中，加入5μL FITC/PI-annexin V，室溫下避光孵育15min，離心棄上清，加入300μL結合緩沖液，流式細胞儀檢測凋亡率，計數(shù)104個細胞。

1.7 統(tǒng)計學方法：應用SPSS11.5統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以±s表示，多組間差異分析采用單因素方差分析，兩組間比較采用q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠睪丸間質(zhì)細胞形態(tài)學觀察：經(jīng)培養(yǎng)24h后，細胞都已經(jīng)貼壁生長，低倍鏡（×10）下見多數(shù)細胞伸展開來，成拉絲狀或樹突狀，間質(zhì)細胞核呈圓形或卵圓形，位于胞質(zhì)中央，其胞質(zhì)輪廓為多角形，一般有3～4個突起，有時可見有大小不一的空泡狀結構。高倍鏡（×40）下觀察，細胞核清晰可見，有的細胞2～3個核仁，胞質(zhì)內(nèi)有空泡狀結構，部分細胞邊界不清（圖1）。

2.2 Bax和Bcl-2基因mRNA表達檢測結果：大鼠睪丸間質(zhì)細胞經(jīng)不同濃度DEHP處理24h后，Bax基因mRNA表達隨DEHP劑量增加，表達增強，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；Bcl-2基因mRNA表達隨DEHP劑量增加而降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖2。

2.3 Bax和Bcl-2蛋白表達檢測結果：大鼠睪丸間質(zhì)細胞經(jīng)不同濃度DEHP處理24h后，經(jīng)方差分析，Bax蛋白表達隨DEHP劑量增加而增強，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；Bcl-2蛋白表達隨DEHP劑量增加而降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1，圖3。

2.4 間質(zhì)細胞凋亡檢測結果：大鼠睪丸間質(zhì)細胞經(jīng)不同濃度DEHP處理24h后，隨DEHP劑量增加，細胞凋亡率增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 間質(zhì)細胞Bax和Bcl-2基因表達及細胞凋亡率檢測結果Table 1 Results of Bax and Bcl-2 expressions and cell apoptosis rates

3 討 論

DEHP對人類生存環(huán)境的嚴重污染，已成為世界范圍內(nèi)威脅人類生存和健康的一大公害。DEHP進入人體的途徑主要有：①日常生活的接觸，食品在加工、包裝、儲存、運輸過程中受到污染，通過消化道進入體；空氣中的DEHP和空氣中溶膠粒子結合，通過呼吸道進入人體；含有DEHP物品，在使用中通過皮膚進入人體。②醫(yī)療活動，各種醫(yī)療設備包括輸液設備、血袋等都是含有DEHP的塑料制品，在進行醫(yī)療活動中進入人體。③職業(yè)場所暴露，在工業(yè)生產(chǎn)中，DEHP會泄露到工作環(huán)境中。DEHP是一種脂溶性的環(huán)境雌激素，對處于生長發(fā)育男性胎兒、嬰幼兒及成年男性的生殖系統(tǒng)都可產(chǎn)生毒害。動物實驗［4-6］表明，暴露于DEHP的孕鼠，其雄性子代發(fā)生肛門生殖器距離縮短、乳頭殘留、睪丸下降不全、尿道下裂等幾率增加。暴露于DEHP的雄性幼鼠，其睪丸發(fā)育差，體內(nèi)雄激素水平降低。暴露于DEHP的雄性成年鼠，精液量少，精子數(shù)降低，體內(nèi)雄激素水平降低。

睪丸組織主要由生精細胞、支持細胞和間質(zhì)細胞組成，精子發(fā)生是一個極其復雜的過程，在這一過程中，曲細精管上皮在形態(tài)及生化方面均要經(jīng)歷周期性的變化。睪丸間質(zhì)細胞分布在生精小管間的結締組織中，其主要功能是產(chǎn)生睪酮，分泌的睪酮占睪酮總量的95％，與性功能維持、精子發(fā)生與成熟等生理過程密切相關。程序化細胞死亡亦稱細胞凋亡，是在基因控制下的一種細胞自我消亡形式。睪丸間質(zhì)細胞存在一定程度的凋亡，機體通過凋亡去除嚴重損傷、畸變和衰老的間質(zhì)細胞，以維持間質(zhì)細胞質(zhì)量和數(shù)量的相對穩(wěn)定，保證其發(fā)揮正常功能。但是間質(zhì)細胞過度凋亡會使睪酮的分泌量減少，導致生精細胞凋亡增加，精子數(shù)量下降。睪丸組織中的間質(zhì)細胞是DEHP雄性生殖毒性作用的靶細胞［7］。本研究結果顯示，體外培養(yǎng)的大鼠睪丸間質(zhì)細胞經(jīng)10、50、100nmol/L DEHP作用后，間質(zhì)細胞細胞凋亡率隨DEHP濃度增加而增加。說明DEHP在體外誘導間質(zhì)細胞發(fā)生凋亡。

睪丸間質(zhì)細胞凋亡受多種因素和多基因調(diào)控，Bcl-2基因是人體最主要的抗凋亡基因，它編碼的Bcl-2蛋白主要分布在線粒體外膜、細胞膜內(nèi)表面、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜及核膜等處。Bcl-2抗凋亡的機制目前認為主要有［8］：①拮抗促凋亡基因Bax；②抑制促凋亡的蛋白質(zhì)細胞色素C自線粒體釋放到胞質(zhì)；③阻止胞質(zhì)中的細胞色素C激活caspase通路；④有抗氧化及維持細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)等作用。Bax基因屬于Bcl-2基因家族，編碼的Bax蛋白可與Bcl-2形成異二聚體，對Bcl-2產(chǎn)生阻抑作用。研究［9］發(fā)現(xiàn)Bax/Bcl-2之間的比例關系是決定對細胞凋亡抑制作用強弱的關鍵因素，bax是極其重要的促細胞凋亡基因之一［9］。Bax和Bcl-2基因在睪丸間質(zhì)細胞中表達，多種對睪丸間質(zhì)細胞損傷因素都可通過抑制Bcl-2基因表達和上調(diào)Bax基因表達而誘導間質(zhì)細胞凋亡。本研究結果顯示，體外培養(yǎng)的大鼠睪丸間質(zhì)細胞經(jīng)10、50、100 nmol/L DEHP作用后，間質(zhì)細胞Bcl-2基因表達隨DEHP濃度增加而下降，Bax基因表達隨DEHP濃度增加而增加。說明DEHP在體外也可抑制睪丸間質(zhì)細胞Bcl-2基因表達和上調(diào)Bax基因表達。

綜上所述，DEHP對體外培養(yǎng)的大鼠睪丸間質(zhì)細胞具有毒性作用，可通過抑制Bcl-2基因表達和上調(diào)Bax基因表達而誘導間質(zhì)細胞凋亡。間質(zhì)細胞凋亡增加可減少睪酮的分泌量，影響生精過程，最終導致精子數(shù)量減少，這可能是DEHP雄性生殖毒性的復雜機制之一。（本文圖見封二）

［1］ GRADY R，SATHYANARAYANA S.An update on phthalates and male reproductive development and function［J］.Curr Urol Rep，2012，13（4）：307-310.

［2］ GUO Y，WU Q，KANNAN K.Phthalate metabolites in urine from China，and implications for human exposures［J］.Environ Int，2011，37（5）：893-898.

［3］ JENSEN MS，N?RGAARD-PEDERSEN B，TOFT G，et al. Phthalates and perfluorooctanesulfonic Acid in human amniotic fluid：temporal trends and timing of amniocentesis in pregnancy

EFFECT OF DEHP ON Bax AND Bcl-2 EXPRESSIONS IN RAT LEYDIG CELLS IN VITRO

WUWeiguang，GE Hongyu，HAN Jianqiu
（Department of Obstetrics and Gynecology，the Affiliated Hospital of Logistics College of Chinese People's Armed Police Forces，Tianjin 300162，China）

Objective To investigate the effects of di-2-ethylhexyl phthalate（DEHP）on the expressions of Bax and Bcl-2 genes，and on the apoptosis in rat Leydig cells in vitro.MethodsThe rat Leydig cellswere separated and cultured，and the Leydig cellswere treated with different concentrations of DEHP（10，50，100nmol/L）for 24h.Real time PCR was used to detectmRNA of Bax and Bcl-2 genes，and Western blot was used to detect the protein of Bax and Bcl-2.Furthermore，cell apoptosis rate was estimated by flow cytometry.ResultsCompared with the control group，the expressions of Bcl-2 mRNA and protein decreased（P＜0.05），and the expressions of Bax mRNA and protein in different DEHP groups increased（P＜0.05）in a concentration dependent manner respectively.Meanwhile，the cell apoptosis increased（P＜0.05）in a concentration dependent manner.ConclusionThe DEHP could induce apoptosis in rat Leydig cells by up-regulating the Bax gene expression and down-regulating the Bcl-2 gene expression，which results in Leyding cell dysfunction.

Di-2-ethylhexyl phthalate；testis；stromal cells；rats

R339.211

A

1007-3205（2013）02-0160-04

2012-04-05；

2012-07-22

吳維光（1967-），男，黑龍江大慶人，武警后勤學院附屬醫(yī)院副主任醫(yī)師，副教授，醫(yī)學博士，從事環(huán)境污染與生殖健康研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.02.013