徐 魁 韓 勇

（山東省濟(jì)寧市藥品檢驗(yàn)所，濟(jì)寧272025）

當(dāng)歸藥材HPLC指紋圖譜研究

徐 魁 韓 勇

（山東省濟(jì)寧市藥品檢驗(yàn)所，濟(jì)寧272025）

目的 建立當(dāng)歸藥材RP-HPLC指紋圖譜，為科學(xué)評(píng)價(jià)及有效控制其質(zhì)量提供可靠方法。方法 以0.3%磷酸（pH3.0）-乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。色譜柱為PhenomenexC18（4.6mmX250mm，5μm），柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)290nm。結(jié)果 建立了當(dāng)歸的指紋圖譜的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并對(duì)不同產(chǎn)地當(dāng)歸指紋圖譜的相似度進(jìn)行了分析，共有指紋峰13個(gè)，其中4號(hào)峰為阿魏酸，當(dāng)歸藥材的相似度大于0.9。結(jié)論 采用高效液相色譜法建立當(dāng)歸藥材的指紋圖譜可靠、簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性好，為提高當(dāng)歸藥材質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

當(dāng)歸；高效液相色譜法；指紋圖譜

當(dāng)歸為傘形科植物［1-2］當(dāng)歸Angelica sinensis（Olive）Diels的干燥根，又叫秦歸、云歸、西當(dāng)歸和岷當(dāng)歸，生長(zhǎng)于海拔1800～2500m高寒陰濕地區(qū)。當(dāng)歸主要化學(xué)成分為揮發(fā)油和水溶性兩大部分。其藥理作用有擴(kuò)冠脈以及抗心律失常，對(duì)血液與造血系統(tǒng)也有顯著的藥理作用，并且具有抗腫瘤、抗炎和抗損傷等作用，因此，當(dāng)歸近年來(lái)成為研究的熱點(diǎn)。本文采用高效液相色譜法研究了12批不同產(chǎn)地當(dāng)歸藥材樣品70%甲醇提取液的指紋圖譜，并對(duì)主要成分阿魏酸進(jìn)行了定位，為當(dāng)歸藥材綜合質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 DIONEX P680型高效液相色譜儀（美國(guó)戴安公司），Chromeleon Dionex工作站，UV-1800SPC型紫外可見(jiàn)分光光度（北京譜析通用儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 試藥 阿魏酸（ferulic acid）對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所（110773-200611）。磷酸為天津化學(xué)試劑三廠產(chǎn)品（分析純），甲醇為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品（分析純），三乙胺為上海凌峰化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品（色譜純），乙腈為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品（色譜純），水為純化水（自制）。s1當(dāng)歸對(duì)照藥材購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所（120927-200613，甘肅）。12批當(dāng)歸藥材為市售品：s2甘肅岷縣，s3甘肅岷縣，s4甘肅漳縣，s5甘肅漳縣，s6陜西鳳縣，s7陜西鳳縣，s8陜西鳳縣，s9云南麗江縣，s10云南麗江縣，s11云南麗江縣，s12甘肅渭源縣，s13甘肅渭源縣，經(jīng)作者鑒定勻?yàn)閭阈慰浦参锂?dāng)歸Angelicasinensis（Olive）Diels的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 根據(jù)當(dāng)歸的成分特征及文獻(xiàn)資料檢索，設(shè)置280、290、300、320nm四個(gè)波長(zhǎng)對(duì)色譜條件進(jìn)行考察，綜合考慮基線、色譜峰個(gè)數(shù)、峰形及信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)弱，確定290nm為最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 阿魏酸對(duì)照品的制備 精密稱取阿魏酸對(duì)照品0.01021g，至25ml容量瓶中，用70%甲醇溶解并稀釋至刻度，再精密吸取3ml置于100ml容量瓶中，并用70%甲醇稀釋至刻度。

2.3 當(dāng)歸供試品的制備［3-5］將上述當(dāng)歸藥材粉碎（50目），精密稱取0.5g置具塞三角瓶中，精密量取70%的甲醇25mL加入三角瓶中，密封，靜置30min后進(jìn)行超聲處理60min，放置至室溫，取上清液經(jīng)0.45μm濾膜濾過(guò)。

2.4 色譜分析條件［6-8］色譜柱：PhenomenexC18分析柱（4.6mmX250mm，5μm），柱溫：30±0.5℃。以阿魏酸為參照物，檢測(cè)波長(zhǎng)290nm，進(jìn)樣20μL，記錄時(shí)間108min，流動(dòng)相：（A）0.3%磷酸溶液（pH3.0）-（B）乙腈。梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序（n，%）

2.5 對(duì)照品的選擇 阿魏酸性質(zhì)相對(duì)較穩(wěn)定，峰形較好，基線較平穩(wěn)，峰面積較大，故選阿魏酸作為對(duì)照品（S）。阿魏酸保留時(shí)間為45min，見(jiàn)圖1。

圖1 阿魏酸保留時(shí)間

2.6 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，計(jì)算各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.027%～0.097%，相對(duì)的峰面積RSD為0.51%～2.7%，符合指紋圖譜的檢測(cè)要求。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批供試品溶液，分別在0h，2.5h，5h，7.5h，10h，24h進(jìn)樣，結(jié)果表明，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD≤3%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批當(dāng)歸藥材粗粉（50目），分別精密稱定，按“2.3供試品溶液制備”項(xiàng)下方法平行制備5份供試溶液，再分別按上述液相色譜條件測(cè)定，檢測(cè)HPLC指紋圖譜，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD≤3%，表明方法重復(fù)性良好。

2.9 當(dāng)歸HPLC指紋圖譜的研究［9-10］

2.9.1 共有指紋峰的確定 分別精密稱取12批當(dāng)歸藥材及批當(dāng)歸對(duì)照藥材，按“2.3項(xiàng)供試品的制備”項(xiàng)下制備供試品溶液，并按“2.4色譜條件”項(xiàng)下測(cè)定其指紋圖譜，確定共有指紋峰13個(gè)，其中4號(hào)峰為阿魏酸。樣品的出峰總數(shù)及其共有峰所占比例分別是S1（14，93%）、S2（17，77%）、S3（15，87%）、S4（16，81%）、S5（17，77%）、S6（15，87%）、S7（18，72%）、S8（14，93%）、S9（14，93%）、S10（17，77%）、S11（18，72%）、S12（16，81%）、S13（16，81%）。見(jiàn)圖2。

圖2 當(dāng)歸高效液相指紋圖譜

2.9.2 當(dāng)歸指紋圖譜的相似度評(píng)價(jià) 根據(jù)處理軟件用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件2004A版（國(guó)家藥典委員會(huì)）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，即可計(jì)算出當(dāng)歸樣品指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度。S1～S13相似度分別為0.989、0.980、0.980、0.973、0.975、0.947、0.962、0.930、0.918、0.911、0.905、0.977和0.978。

3 結(jié)果與討論

3.1 結(jié)果 通過(guò)測(cè)定，我們建立了當(dāng)歸的指紋圖譜的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，共有指紋峰13個(gè)，其中4號(hào)峰為阿魏酸峰，樣品與當(dāng)歸對(duì)照品的相似度均在90%以上，平均相似度為95.58%。

3.2 討論

3.2.1 提取條件的選擇 分別以80%的甲醇、70%的甲醇、60%的甲醇作為提取溶劑，比較不同溶劑提取對(duì)指紋圖譜的影響。分析結(jié)果表明，以70%的甲醇作為提取溶劑所得樣品的指紋圖譜峰數(shù)多于其它提取方式，且簡(jiǎn)便易行，故選擇70%的甲醇作為提取溶劑。另取當(dāng)歸藥材，以70%的甲醇作為提取溶劑，比較超聲和回流兩種不同提取方法、不同提取時(shí)間對(duì)色譜峰的影響。結(jié)果表明樣品超聲與回流提取差別不大，超聲60min提取較完

全，故選擇超聲60min作為提取方法。

3.2.2 流動(dòng)相流速優(yōu)化 通過(guò)多次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)分別在0.45ml／min、0.9ml／min及1.2ml／min流速下逐步提高乙腈的比例進(jìn)行色譜分析，分離出13個(gè)共有指紋峰并且不同極性的成分色譜峰分離度符合要求。若開(kāi)始采用0.9ml／min的流速，則需降低乙腈的比例，為了更快的分離極性小的成分則需逐步大幅度提高乙腈的比例，這樣乙腈的比例變化太大，從而導(dǎo)致基線飄移。為了保證各成分充分分離和基線穩(wěn)定，最終決定用梯度洗脫方法進(jìn)行分離，并最終確定流速分別為0.45ml／min、0.9ml／min、1.2ml／min的流速。

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Studies on the HPLC Fingerprints of Radix Angelicae Sinensis

Xu Kui Han Yong
(Jining City Institute for Drug Control,Jining,272025,China)

Absrracr：ObjecriveTo establish the RP-HPLC fingerprints of Radix Angelicae sinensis so as to control its quality．MerhodsA PhenomenexC18 column was used，with mixture liquid of 0.3%H3PO4（pH3.0）-CH3CN mobile phase in gradient mode．，the column temperature was maintained at 30℃．The wavelength of measurement was 290nm．ResulrsThirteen peaks have been gotten from Radix Angelicae sinensis as its fingerprints．The forth peak was ferulic acid and the similarity of samples was more than 0．9．ConclusionThe HPLC fingerprint method was repeatable，feasible in analysis of Radix Angelicae sinensis，and provides standard for the quality control of Radix Angelicae sinensis．

Radix Angelicae sinensis；HPLC；Fingerprints

10.3969／j.issn.1672-2779.2013.15.107

1672-2779（2013）-15-0159-03

張文娟

2013-05-18）