劉哲強(qiáng) 焦 玥 王志英 鄒傳山

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

落葉松毛蟲(chóng)(Dendrolimus superans (Butler))又稱西伯利亞松毛蟲(chóng)，隸屬鱗翅目(Lepidoptera)枯葉蛾科(Lasiocampidae)。國(guó)內(nèi)分布于華北、東北及新疆北部，是我國(guó)東北林區(qū)的重要害蟲(chóng)，主要危害落葉松(Larix spp.)、紅松(Pinus koraiensis)、油松(P.tabulaeformis)、樟子松(P. sylvestris var. mongolica)、云杉(Picea asperata)、冷杉(Abies fabric)等針葉樹(shù)種。該蟲(chóng)暴發(fā)時(shí)吃光樹(shù)木針葉，形似火燒，甚至使松樹(shù)枯死［1］?；瘜W(xué)防治能迅速降低蟲(chóng)口密度，控制其傳播與蔓延，達(dá)到最佳控制效果，一直是防治落葉松毛蟲(chóng)的有效措施之一。超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)為昆蟲(chóng)的重要保護(hù)酶。SOD 能將有害的超氧自由基轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫，CAT 能將過(guò)氧化氫分解為水。因此，SOD 和CAT 可使細(xì)胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生與清除維持一種動(dòng)態(tài)平衡，以防止自由基毒害［2］。目前，關(guān)于落葉松毛蟲(chóng)SOD 和CAT 的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。筆者測(cè)定了生產(chǎn)防治中常用的6 種農(nóng)藥對(duì)落葉松毛蟲(chóng)離體和活體SOD 和CAT 活性的影響，研究了落葉松毛蟲(chóng)在農(nóng)藥脅迫下體內(nèi)的生理變化，為有效防治落葉松毛蟲(chóng)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)

落葉松毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)于2009年6月采自內(nèi)蒙古自治區(qū)克什克騰旗芝瑞鎮(zhèn)落葉松人工林，并于(25 ±1)℃，光照周期為14 h 光照、10 h 黑暗，相對(duì)濕度75%的條件下用興安落葉松松針進(jìn)行室內(nèi)人工飼養(yǎng)。

1.2 供試試劑及農(nóng)藥

甲硫氨酸(Met)、氮藍(lán)四唑(NBT)、核黃素(VB2)、苯基硫脲(N－phenylthiourea)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、乙二胺四乙酸(EDTA)、考馬斯亮藍(lán)G －250 等均購(gòu)于SIGMA 公司;磷酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、丙酮、三氯乙酸、過(guò)氧化氫和牛血清蛋白均為分析純。供試農(nóng)藥有25%滅幼脲(通化農(nóng)藥化工股份有限公司)、1.2%阿維菌素(黑龍江平山林業(yè)制藥廠)、40%辛硫磷(山東勝邦魯南農(nóng)藥有限公司)、2.5%高效氯氟氰菊酯(黑龍江平山林業(yè)制藥廠)、80%敵敵畏(山東高密市綠洲化工有限公司)、2.5%高效氯氰菊酯(山東大成農(nóng)藥股份有限公司)。

1.3 研究方法

酶液的制備:取5 ～6 頭落葉松毛蟲(chóng)6 齡幼蟲(chóng)，清除食道內(nèi)雜質(zhì)后用0.1 mol·L－1pH 7.5 的磷酸緩沖液(PBS)清洗體表，置于預(yù)冷的研缽中，加入10 mL 預(yù)冷PBS 緩沖液，于4 ℃、8 000 r·min－1下離心15 min，取上清液于4 ℃、12 000 r·min－1再次離心10 min，取上清液作為酶源。

SOD 活性測(cè)定:參照NBT 法［3－4］測(cè)定。反應(yīng)體系中含有80 μmol·L－1核黃素、77 μmol·L－1NBT、13 mmol·L－1MET、0.1 mmol·L－1EDTA 和50 μL酶液。于4 000 lx 下光照10 min 后遮光停止反應(yīng)，測(cè)定OD560，并測(cè)定酶液的蛋白質(zhì)含量，以NBT 被抑制50%為一個(gè)活性單位(U)，酶活性以U·min－1·mg－1表示，每組3 次重復(fù)。

CAT 活性測(cè)定:CAT 活性測(cè)定參照張友軍等的方法［5］。反應(yīng)體系含有0. 1 mol·L－1pH7. 0 的PBS、0.08% H2O2和50 μL 酶液，測(cè)定OD240，每30 S記數(shù)一次，共記錄3 min，計(jì)算OD240每分鐘的變化值。同時(shí)測(cè)定酶液的蛋白質(zhì)含量，OD240每減小0.1定為一個(gè)酶活單位(U)，酶活性以U·min－1·mg－1表示，每處理3 次重復(fù)。

離體SOD 活性的抑制測(cè)定:分別將6 種農(nóng)藥配制成0.01、0.05、0.10、0.50、1.00 g·L－1。測(cè)定方法同SOD 活性測(cè)定。總反應(yīng)體積3.65 mL，3.00 mL反應(yīng)液加入0.05 mL 農(nóng)藥、0. 10 mL 稀釋酶液和0.50 mL VB2后于30 ℃、4 000 lx 下光照10 min，測(cè)定OD560，同時(shí)設(shè)定對(duì)照組，每處理3 次重復(fù)。

離體CAT 活性的抑制測(cè)定:測(cè)定方法同CAT活性測(cè)定?？偡磻?yīng)體積3.25 mL，3.00 mL 反應(yīng)液加入0.05 mL 農(nóng)藥和0.20 mL 稀釋酶液后，測(cè)定OD240每分鐘的變化值，同時(shí)設(shè)定對(duì)照組，每組3 次重復(fù)。

活體SOD 和CAT 活性的測(cè)定:分別將6 種農(nóng)藥配成0.001 g·L－1低質(zhì)量濃度，采用點(diǎn)滴法處理落葉松毛蟲(chóng)6 齡幼蟲(chóng)，點(diǎn)滴劑量為1 μL，分別處理12、48、72 h 后挑取活潑幼蟲(chóng)用于酶活性測(cè)定，同時(shí)以點(diǎn)滴蒸餾水處理為對(duì)照。

蛋白質(zhì)含量測(cè)定:測(cè)定參照Bradford 的考馬斯亮藍(lán)G－250 法［6］。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析:試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并用Excel 2003 和SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析;酶活性抑制率=(對(duì)照活性－殘留活性)/對(duì)照活性×100%。以殺蟲(chóng)劑濃度的負(fù)對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)計(jì)算線性回歸方程，并通過(guò)線性方程求出IC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 農(nóng)藥對(duì)離體SOD 和CAT 活性的影響

高效氯氰菊酯、阿維菌素、滅幼脲和高效氯氟氰菊酯對(duì)離體SOD 均有不同程度的抑制作用，抑制率與質(zhì)量濃度成正比。而有機(jī)磷類農(nóng)藥(辛硫磷和敵敵畏)在低濃度(＜0.10 g·L－1)時(shí)表現(xiàn)出對(duì)離體SOD 誘導(dǎo)激活作用(見(jiàn)表1)。高效氯氰菊酯、阿維菌素、辛硫磷、敵敵畏、滅幼脲、高效氯氟氰菊酯對(duì)體外SOD 抑制中濃度依次為2. 41 × 10－3、2. 32 ×10－2、2.24 ×102、3. 36 ×103、9. 93 ×10－1、1. 53 ×10－2g·L－1;離體SOD 對(duì)6 種農(nóng)藥的敏感性由高到低依次為高效氯氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、阿維菌素、滅幼脲、辛硫磷、敵敵畏(表2)。Duncan 法多重比較結(jié)果表明，阿維菌素(0.01 g·L－1)、敵敵畏(＜0.05 g·L－1)處理SOD 活性與對(duì)照差異不顯著;高效氯氰菊酯和辛硫磷濃度小于0.05 g·L－1時(shí)，處理組SOD 活性顯著高于對(duì)照，而其余處理組的SOD活性顯著小于對(duì)照(見(jiàn)表1)。

表1 農(nóng)藥對(duì)落葉松毛蟲(chóng)6 齡幼蟲(chóng)離體SOD、CAT 的活性影響 U·min －1·mg －1

6 種農(nóng)藥對(duì)落葉松毛蟲(chóng)6 齡幼蟲(chóng)體外CAT 活性均有抑制作用，抑制程度存在明顯差異，抑制率與質(zhì)量濃度成正比(見(jiàn)表1)。高效氯氰菊酯、阿維菌素、辛硫磷、敵敵畏、滅幼脲和高效氯氟氰菊酯對(duì)體外CAT 抑制中濃度依次為1.21 ×105、18.32、4.79 ×105、1.36 ×107、0.44、47.92 g·L－1。其離體CAT對(duì)6 種農(nóng)藥的敏感性由高到低依次為滅幼脲、阿維菌素、高效氯氟氰菊酯、高效氯氰菊酯、辛硫磷、敵敵畏(見(jiàn)表2)。多重比較結(jié)果表明，利用高效氯氰菊酯(≤0.10 g·L－1)、阿維菌素(0.01 g·L－1)及辛硫磷(0.01 g·L－1)處理時(shí)，處理組CAT 活性與對(duì)照間差異不顯著;而其余處理CAT 活性顯著低于對(duì)照(見(jiàn)表1)。

2.2 農(nóng)藥對(duì)體內(nèi)SOD 和CAT 活性的影響

用0.001 g·L－1的6 種農(nóng)藥處理落葉松幼蟲(chóng)12 h，結(jié)果表明，滅幼脲處理組SOD 活性高于對(duì)照，但差異不顯著，阿維菌素處理組低于對(duì)照，但差異也不顯著;而其它4 個(gè)農(nóng)藥處理組均顯著低于對(duì)照;其中高效氯氰菊酯處理組SOD 活性最低，僅為對(duì)照的0.628 倍;處理48 h，滅幼脲及阿維菌素2 個(gè)處理組的SOD 活性均顯著低于對(duì)照，辛硫磷處理組也低于對(duì)照，但差異不顯著;高效氯氰菊酯和高效氯氟氰菊酯處理組SOD 活性顯著高于對(duì)照，敵敵畏處理組也高于對(duì)照，但其差異不顯著;6 個(gè)處理中，滅幼脲處理SOD 活性最低，僅為對(duì)照的0.565 倍;高效氯氰菊酯處理SOD 活性最高，為對(duì)照的1.441 倍;處理72 h，敵敵畏和阿維菌素處理SOD 活性顯著高于對(duì)照，分別為對(duì)照的1.839、1.798 倍;滅幼脲處理SOD 活性為對(duì)照的1.030 倍，但差異不顯著;其余3種農(nóng)藥處理組的SOD 活性均低于對(duì)照，但與對(duì)照差異不顯著，其中高效氯氰菊酯處理SOD 活性最低，僅為對(duì)照的0.842 倍(見(jiàn)表3)。

表2 農(nóng)藥對(duì)離體SOD、CAT 活性的抑制中濃度

表3 農(nóng)藥對(duì)落葉松毛蟲(chóng)6 齡幼蟲(chóng)體內(nèi)SOD、CAT 活性影響 U·min －1·mg －1

6 種農(nóng)藥處理12 h，只有高效氯氟氰菊酯處理組的CAT 活性低于對(duì)照，但差異不顯著;阿維菌素處理組CAT 活性高于對(duì)照，但與對(duì)照間差異不顯著;而其余處理組的CAT 活性均顯著高于對(duì)照，其中滅幼脲處理組CAT 活性最高，為對(duì)照的1. 539倍;處理48 h，只有高效氯氰菊酯處理組CAT 的活性顯著低于對(duì)照，僅為對(duì)照的0.667 倍;敵敵畏處理組CAT 的活性略高于對(duì)照，但其差異不顯著;其它處理組CAT 的活性均顯著高于對(duì)照，其中高效氯氟氰菊酯處理組CAT 活性最高，為對(duì)照的1.600 倍;處理72 h，阿維菌素處理組CAT 活性最低且與對(duì)照差異顯著，僅為對(duì)照的0.520 倍;滅幼脲處理CAT活性略高于對(duì)照，但差異不顯著，其余處理組CAT活性均顯著高于對(duì)照，其中高效氯氟氰菊酯處理CAT 活性最高，為對(duì)照的1.485 倍(見(jiàn)表3)。

3 結(jié)論與討論

昆蟲(chóng)體內(nèi)的SOD、POD 及CAT 在其生長(zhǎng)發(fā)育、化學(xué)農(nóng)藥滲入、病原微生物侵染以及其他逆境中發(fā)揮著清除自由基、保護(hù)機(jī)體免受或減輕傷害的作用［7－10］。SOD 和CAT 活性與周圍環(huán)境(溫度、濕度、農(nóng)藥脅迫等)及食物等有密切關(guān)系。低溫促進(jìn)麥紅吸漿蟲(chóng)幼蟲(chóng)(Sitodiplosis mosellana)SOD 和CAT的活力，而高溫卻導(dǎo)致其活力下降［11］;馬尾松毛蟲(chóng)(Dendrolimus punctatus)取食受害新葉后馬尾松的CAT 活力上升［12］。此外，SOD 和CAT 活性與農(nóng)藥種類、濃度及處理時(shí)間存在必然聯(lián)系。雙齒圍沙蠶(Perinereis aibuhitensis)CAT 活性與馬拉硫磷的濃度和處理時(shí)間存在效應(yīng)關(guān)系［13］;天幕毛蟲(chóng)(Malacosoma neustria testacea)4 齡幼蟲(chóng)離體和活體SOD 比活力大小與高效氯氰菊酯、阿維菌素和辛硫磷的質(zhì)量濃度有關(guān)［14］。

本研究表明，高效氯氰菊酯和高效氯氟氰菊酯對(duì)落葉松毛蟲(chóng)6 齡幼蟲(chóng)離體SOD 活性抑制性最強(qiáng)，其IC50分別為2.41 ×10－3、1.53 ×10－2g·L－1。相對(duì)而言，敵敵畏和辛硫磷不僅對(duì)離體SOD 抑制性最弱，甚至在0.05 g·L－1質(zhì)量濃度以下時(shí)反而表現(xiàn)出對(duì)SOD 活性的誘導(dǎo)激活作用;滅幼脲和阿維菌素對(duì)CAT 活性的抑制能力大于其余類農(nóng)藥。6 種供試農(nóng)藥的低濃度劑量處理后，均打破了落葉松毛蟲(chóng)6 齡幼蟲(chóng)體內(nèi)自由基的平衡，并表現(xiàn)出明顯的時(shí)間效應(yīng)，其活性變化與外界刺激物相應(yīng)的強(qiáng)度有關(guān)，這是昆蟲(chóng)為維持體內(nèi)平衡清除自由基的調(diào)節(jié)過(guò)程。在生物體正常的生理?xiàng)l件下，由于體內(nèi)自由基不斷產(chǎn)生的同時(shí)也被不斷清除，因而未表現(xiàn)出自由基對(duì)機(jī)體的明顯損傷。由于生物體內(nèi)某些生理作用或生化反應(yīng)需要O2的參與(如:清除入侵微生物)，由于O2參加反應(yīng)，致使其機(jī)體內(nèi)自由基不斷地產(chǎn)生，這時(shí)就需要SOD、CAT 等保護(hù)酶之間的協(xié)調(diào)作用來(lái)清除過(guò)多的自由基，從而使其體內(nèi)維持在有利無(wú)害、生理性低水平、穩(wěn)定平衡的自由基濃度［15－16］。由此可見(jiàn)，因農(nóng)藥種類的不同，刺激昆蟲(chóng)體內(nèi)產(chǎn)生的自由基濃度也有一定差異。落葉松毛蟲(chóng)6 齡幼蟲(chóng)在面對(duì)不同農(nóng)藥脅迫時(shí)，為維持體內(nèi)的系統(tǒng)平衡，SOD 和CAT 活性隨農(nóng)藥刺激的強(qiáng)弱而變化，這也是昆蟲(chóng)適應(yīng)逆境及抗藥性形成的主要機(jī)制之一。

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