朱玉婷，田 瑞，楊 潔，袁 杰，莫開菊,*

(1.湖北民族學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000；2.生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 恩施 445000；3.湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院，湖北 恩施 445000)

傅里葉紅外光譜法測(cè)定硫酸酯化葛仙米多糖的取代度

朱玉婷1,2，田 瑞1,2，楊 潔3，袁 杰3，莫開菊1,2,*

(1.湖北民族學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000；2.生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 恩施 445000；3.湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院，湖北 恩施 445000)

研究以葛仙米多糖合成不同取代度的葛仙米多糖硫酸酯為標(biāo)樣，氯化鋇-明膠比濁法測(cè)定標(biāo)樣的取代度，傅里葉里紅外光譜作為工具測(cè)定這一系列產(chǎn)品取代度的方法。吸光度用基線法得到，對(duì)所有不同探針譜帶、參比譜帶和基線作圖法的組合進(jìn)行比較，并通過探針譜帶和參比譜帶吸光度比值A(chǔ)探針/A參比與取代度的比值的平均相對(duì)偏差評(píng)價(jià)每種組合的優(yōu)劣。結(jié)果表明：對(duì)硫酸酯化葛仙米多糖最合適的吸光度比值A(chǔ)探針/A參比為H1261BL1/H1418BL1，結(jié)果與傳統(tǒng)方法所測(cè)得的硫酸酯化取代度相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.993。

葛仙米；多糖硫酸酯；傅里葉紅外光譜；取代度

葛仙米(Nostoc spharoids Kützing)是一種低等多細(xì)胞絲狀藍(lán)藻，屬藍(lán)藻門(Cyanopyhta)藍(lán)藻綱(Cyanohpyceae)，段殖藻目(Hormogonales)念珠藻科(Nostocaceae)念珠藻屬(Nostoc.)[1]，多糖是其中的主要成分之一[2-3]。多糖經(jīng)硫酸酯化改性后，具有多種生物活性。利用硫酸酯化這種修飾方式來增加多糖的生理活性，已經(jīng)成為當(dāng)前開發(fā)藥品和保健功能食品的重要手段之一[4-5]。楊鐵虹等[6]發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸多糖及其硫酸酯化產(chǎn)物既有顯著的抗凝血活性，又有明顯的止血作用。劉憲麗等[7]發(fā)現(xiàn)褐藻多糖硫酸酯可增強(qiáng)IL6、IL12、IL18和TNF等多種腫瘤相關(guān)細(xì)胞因子的分泌，還具有增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞和分子免疫活性的作用，是良好的免疫調(diào)節(jié)劑。然而對(duì)于多糖硫酸酯化取代程度的測(cè)定和計(jì)算方法研究不多。一般是采用氯化鋇-明膠比濁法分析，但分析耗時(shí)較長，操作要求高。本實(shí)驗(yàn)通過紅外光譜特征峰吸光度定量葛仙米多糖硫酸酯的取代程度，以期為定量硫酸酯化程度提供一種新型有效的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葛仙米產(chǎn)自湖北鶴峰縣走馬鎮(zhèn)。

無水乙醇、吡啶、硫酸鉀、N,N-二甲基甲酰胺、氫氧化鈉、明膠、 氯磺酸、氯化鋇均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；集熱式磁力攪拌器 金壇市科興儀器廠；LX1-II低速大容量多管離心機(jī) 上海安亭科技儀器廠；UVWIN5型紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Avatar370型Fourier變換紅外光譜儀 美國熱電尼高力儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 磺化試劑的制備[8]

將裝有冷凝裝置和恒壓滴液漏斗的三頸燒瓶置于冰鹽浴中，加入10mL吡啶，在劇烈攪拌的狀態(tài)下按照一定比例緩慢滴加氯磺酸，反應(yīng)溫度控制在0℃左右，反應(yīng)時(shí)間為40min，此時(shí)會(huì)有大量淡黃色物質(zhì)生成。

1.3.2 硫酸酯化反應(yīng)

準(zhǔn)確稱取0.2g葛仙米多糖，懸浮于60mL DMF(N,N-二甲基甲酰胺)中(可超聲處理20min)，將懸浮液加入到磺化試劑中，在一定溫度下攪拌反應(yīng)一定的時(shí)間。反應(yīng)結(jié)束后將三頸燒瓶迅速移入冰浴中冷卻，用4mol/L NaOH溶液調(diào)pH6～8，流水透析72h，真空濃縮，干燥得葛仙米多糖硫酸酯[9]。

1.3.3 取代度(degree of substitution，DS)的測(cè)定[10]

精確稱取葛仙米多糖硫酸酯5.0mg，溶于3mL濃度為1mol/L的鹽酸中，封管，100℃水解6h。吸取水解液0.5mL，采用氯化鋇-明膠比濁法進(jìn)行樣品分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)為6.53%。按下式計(jì)算硫酸基的取代度。

式中：S為樣品中硫酸根的質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%。

1.3.4 紅外光譜測(cè)定方法[11]

將粉末樣品通過KBr壓片法制得薄片，用傅里葉變換紅外光譜儀(fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)TIR)測(cè)定，掃描范圍400～4000cm-1，分辨率0.5cm-1，以空氣做參比。在吸收光譜上，以基線法測(cè)定吸收帶的峰高和峰面積，用于定量計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 葛仙米多糖與硫酸酯化葛仙米多糖紅外譜圖的比較

由圖1可知，4000～500cm-1波數(shù)范圍內(nèi)含有多糖性質(zhì)的一般特征吸收，即：3432cm-1處為—OH和—NH2的吸收峰，2921cm-1左右為C—H的伸縮振動(dòng)吸收峰，1636cm-1左右為羧酸鹽離子的振動(dòng)峰[12]，1418cm-1左右為C—H的彎曲振動(dòng)吸收峰，1054cm-1左右為吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)中C=O的吸收峰[13]。

圖1 葛仙米多糖的紅外光譜圖Fig.1 FTIR spectrum of polysaccharides extracted from Nostoc sphaeroides Kützing

圖2 硫酸酯化葛仙米多糖的紅外光譜圖Fig.2 FTIR spectra of sulfated Nostoc sphaeroides Kützing polysaccharides with different DS

由圖2A可知，與葛仙米多糖相比，其硫酸酯化產(chǎn)物在1261cm-1和808cm-1附近明顯多出兩個(gè)特征吸收峰，分別為S=O的伸縮振動(dòng)峰和C—O—S的伸縮振動(dòng)峰，說明經(jīng)硫酸化反應(yīng)，硫酸基團(tuán)己結(jié)合在糖鏈上。并且從DS=0.3到DS=1在3432cm-1處的羥基峰強(qiáng)度依次降低，而1261cm-1處的S=O及808cm-1處的C—O—S的伸縮振動(dòng)峰強(qiáng)度依次增大。說明產(chǎn)物的特征吸收峰的伸縮振動(dòng)強(qiáng)度與其硫酸化程度具有一定的相關(guān)性。

2.2 硫酸酯化葛仙米多糖取代度的測(cè)定

在紅外定量分析中，通常采用基線法進(jìn)行譜帶吸光度(A)的測(cè)量，有測(cè)量吸收峰高度[14](H)和測(cè)量吸收峰面積(S)兩種[15]。以探針譜帶和參比譜帶吸光度之比A探針/A參比對(duì)一系列已知標(biāo)樣的取代度作圖，就可以確定A探針/A參比與傳統(tǒng)方法所測(cè)得的硫酸酯化取代度的相關(guān)性。因而首要解決的問題是如何確定探針譜帶、參比譜帶和基線。

對(duì)硫酸酯化葛仙米多糖，根據(jù)2.1節(jié)的分析，確定波數(shù)1261cm-1或808cm-1為探針譜帶。由于合成時(shí)1636cm-1左右的羧酸鹽離子，1418cm-1左右的C—H，1054cm-1左右的吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)中C=O不參與反應(yīng)，所以可分別用作參比譜帶。在進(jìn)行峰高測(cè)定時(shí)，基線可有BL1、BL2和BL3三種作法(圖2A)。分析譜帶1261cm-1處的振動(dòng)峰受到兩側(cè)鄰峰的干擾其基線可取BL1、BL2兩種，而1636cm-1左右的振動(dòng)峰在BL2外不能作為以BL2為基線時(shí)的參比譜帶；分析譜帶808cm-1處的振動(dòng)峰受鄰側(cè)1054cm-1左右的吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)中C=O的強(qiáng)峰干擾其基線取BL3，于是可以得到10種組合。在進(jìn)行峰面積測(cè)定時(shí)，能準(zhǔn)確反映探針峰與參比峰的吸光度的基線如圖2B所示，于是可以得到6種組合。將不同組合A探針/A參比與DS之商定義為x，計(jì)算出測(cè)量值x的相對(duì)偏差(relative deviation，RD)，并以平均相對(duì)偏差的大小來評(píng)價(jià)工作曲線的線性關(guān)系的好壞。

式中：RD為相對(duì)偏差；APB為探針譜帶吸光度；ARB為參比譜帶吸光度。

葛仙米多糖硫酸化的分析結(jié)果見表1、2。

表1 對(duì)于不同取代度的硫酸酯化葛仙米多糖不同組合H探針/H參比的相對(duì)偏差Table1 Relative derivation (RD) ofHPPBB/HRRBB ratio for sulfated Nostoc sphaeroides Kützing polysaccharides with different DS

由表1可知，在以峰高計(jì)算時(shí)，探針譜帶以1261cm-1為好，而參比譜帶以1418cm-1為好。這樣最佳的工作曲線為H1261BL1/H1418BL1對(duì)取代度的曲線(圖3)，由圖3中各點(diǎn)擬合出直線y = 2.2379x ＋ 0.3806，r=0.993。說明紅外譜圖峰高與取代度呈良好的相關(guān)性，因此以紅外光譜分析峰的校正高度來計(jì)算取代度具有較高的準(zhǔn)確性。

圖3 對(duì)于不同取代度的葛仙米多糖硫酸酯H1226611BBLL/H1441188BBLL與11DS值的關(guān)系圖Fig.3 Plot of H1261BL1/H1418BL1vs DS values for sulfated Nostoc sphaeroides Kützing polysaccharides

表2 對(duì)于不同取代度的硫酸酯化葛仙米多糖不同組合S探針/S參比的相對(duì)偏差Table2 Relative derivation (RD) of SPB/SRB ratios for sulfated Nostoc sphaeroides Kützing polysaccharides

由表2可知，在以峰面積計(jì)算時(shí)，探針譜帶以1261cm-1為好，而參比譜帶以1418cm-1為最好，最佳的工作曲線為S1261BL1/S1418BL1對(duì)DS的曲線(圖4)，由圖4中各點(diǎn)擬合出直線y = 8.236x -0.3773，r=0.953，說明紅外譜圖與取代度亦呈較好的相關(guān)性，但與峰高相比其相關(guān)性相對(duì)較差。將S1261BL1/S1418BL1和H1261BL1/H1418BL1分別代入其擬合的直線方程，計(jì)算出相應(yīng)的DS值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者差異不顯著(P=0.063)。綜合考慮RSD和擬合曲線的相關(guān)性，確定葛仙米多糖硫酸化程度的定量方法應(yīng)取峰高測(cè)量法為宜。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，比濁法測(cè)定DS的RSD值為6.53%，同樣將H1261BL1/H1418BL1帶入其擬合的直線方程，計(jì)算出的一組DS值與比濁法測(cè)定的一組DS值二者差異也不顯著(P=0.187)。

圖4 對(duì)于不同取代度的葛仙米多糖硫酸酯S1226611BBLL/S1441188BBLL與DDS值的關(guān)系圖11Fig.4 Plot of S1261BL/S1418BLvs DS values for sulfated Nostoc sphaeroides11Kützing polysaccharides

董炎明等[11,16]研究了用FTIR測(cè)定鄰苯二甲?；瘹ぞ厶?、羧?；瘹ぞ厶羌扒枰一鶜ぞ厶堑娜〈鹊姆椒?，結(jié)果表明，鄰苯二甲?；瘹ぞ厶堑目?cè)〈菵S1、環(huán)化鄰苯二甲?；瘹ぞ厶堑娜〈菵S2與其紅外吸收峰強(qiáng)度均呈良好線性關(guān)系，線性關(guān)系的斜率分別為2.45(A1712BL1/A1391)與2.63(A1775BL1/A1654BL1)；羧酰化殼聚糖和氰乙基殼聚糖兩個(gè)系列的DS與其紅外吸收峰強(qiáng)度亦呈良好線性關(guān)系，兩種組合的工作曲線的斜率分別為2.1(對(duì)A1740BL1/A1527BL1)、0.59 (對(duì)A2249/A1590BL1)和0.66(對(duì)A2249/A1590BL2)。硫酸酯化葛仙米多糖的合成反應(yīng)機(jī)理和產(chǎn)物結(jié)構(gòu)雖然復(fù)雜，但其取代度DS只要在0.3～1之間，都可以根據(jù)本實(shí)驗(yàn)提供的工作曲線作快速評(píng)價(jià)，最佳A探針/A參比是H1261BL1/H1418BL1，工作曲線為：

3 結(jié) 論

綜上所述，利用比濁法測(cè)定DS的RSD為6.53%，與紅外光譜法中峰高比測(cè)定的DS值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，相比較比濁法而言，紅外光譜法可以快速準(zhǔn)確測(cè)定葛仙米多糖硫酸酯的取代度。方法是以峰高H1261BL1/H1418BL1作為A探針/ A參比，工作曲線為結(jié)果與傳統(tǒng)方法測(cè)得的硫酸酯取代度的相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.993。

有關(guān)采用紅外光譜定量測(cè)定多糖取代基取代度的研究不多，多為測(cè)定殼聚糖脫乙酰度[17-19]和鄰苯二甲酰[11]、羧酰、氰乙基[16]取代度，本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果可為紅外光譜定量測(cè)定多糖取代基種類提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Determination of Degree of Substitution of Sulfated Nostoc sphaeroides Kützing Polysaccharide by FTIR Spectroscopy

ZHU Yu-ting1,2，TIAN Rui1,2，YANG Jie3，YUAN Jie3，MO Kai-ju1,2,*
(1. School of Biological Science and Technology, Hubei University for Nationalities, Enshi 445000, China；2. Hubei Key Laboratory of Biological Resource Conservation and Utilization, Enshi 445000, China；3. The Affiliated Hospital of Medical School of Hubei Institute for Nationalities, Enshi 445000, China)

Sulfated Nostoc sphaeroides Kützing polysaccharides with different degrees of substitution (DS) were used as reference standards for DS determination by a barium chloride-gelatin turbidimetric method. FTIR spectroscopy was used for instrumental determination of DS. The baseline absorbance was recorded. Different combinations of probe band, reference band and baseline were comparatively evaluated based on the average relative deviation of ratio of Aprobe/Areferenceto DS. H1261BL1/H1418BL1was found to be optimal for DS calculation with a correlation coefficient of 0.993 in comparison with DS values determined by the traditional method.

Nostoc sphaeroides Kützing；polysaccharide sulfate；Fourier transform infrared spectrometer；degree of substitution

O657.3

A

1002-6630(2013)04-0150-04

2012-07-24

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31171670)

朱玉婷(1984—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)。E-mail：zz060101@126.com

*通信作者：莫開菊(1965—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称芳庸ぜ疤烊划a(chǎn)物化學(xué)。E-mail：hbmymkj@163.com