梁大勇，趙 晨，黃 芳，宋愛榮*

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 山東省應(yīng)用真菌重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266109)

響應(yīng)面法優(yōu)化桑黃發(fā)酵液總多糖的提取工藝

梁大勇，趙 晨，黃 芳，宋愛榮*

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 山東省應(yīng)用真菌重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266109)

為確定桑黃發(fā)酵液多糖提取的最佳工藝條件，以桑黃多糖的含量為考察指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對(duì)主要提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，并得到回歸模型。結(jié)果表明：桑黃發(fā)酵液多糖提取的最優(yōu)工藝條件參數(shù)為提取pH12、提取溫度96℃、提取時(shí)間1.6h。在此條件下，桑黃多糖含量達(dá)到11.67mg/mL。實(shí)驗(yàn)證明模型擬合程度良好，誤差較小。

桑黃；液體發(fā)酵；多糖；提取；響應(yīng)面法

桑黃Phellinus igniarius(L.:Fr.)Quél.是一種頗具藥用價(jià)值的多年生大型真菌，因多生長(zhǎng)于桑屬植物上，且子實(shí)體多為黃褐色而得名，又名火木層孔菌、桑臣、桑耳[1-2]，桑黃成分復(fù)雜，含有多糖、黃酮、三萜、甾醇、香豆素類化合物等多種活性成分[3-5]。在我國(guó)民間桑黃用于治療血崩、血淋、脫肛瀉血、臍腹?jié)?、閉經(jīng)、脾虛泄瀉等[6]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，桑黃多糖具有抗腫瘤、抑制肝纖維化、提高免疫力、降低血糖、抗病毒等功效[7-9]，且抗腫瘤活性優(yōu)于多種真菌類藥物[10]。

桑黃在自然界中形成子實(shí)體稀少，而且形成可用子實(shí)體需要多年，而人工栽培難度較大、周期較長(zhǎng)，這就造成此菌的價(jià)格較高，難以滿足市場(chǎng)需要。因此，通過野生環(huán)境獲得桑黃子實(shí)體已不能滿足需要，桑黃液體發(fā)酵培養(yǎng)獲得大量活性物質(zhì)技術(shù)開始應(yīng)運(yùn)而生，使得桑黃多糖成為穩(wěn)定的工業(yè)產(chǎn)品來源[11]。本研究采用液體深層發(fā)酵的方法，獲得桑黃發(fā)酵液，并通過Box-Behnken響應(yīng)曲面分析法設(shè)計(jì)多糖提取實(shí)驗(yàn)[12-13]，獲得數(shù)據(jù)，有效地建立多糖含量和連續(xù)參數(shù)變量之間的定量關(guān)系，從而快速確定最佳生產(chǎn)條件，為大規(guī)模生產(chǎn)桑黃發(fā)酵液多糖提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑黃(Phellinus igniarius)菌種由山東省應(yīng)用真菌重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

平板菌種培養(yǎng)基：葡萄糖2%，酵母膏0.5%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，pH6.8，瓊脂2%；液體菌種培養(yǎng)基：葡萄糖2%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，酵母膏0.5%，pH6.8；液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖3%，酵母膏0.3%，馬鈴薯淀粉1%，KH2PO40.01%，MgSO40.05%，pH6.8。

1.2 儀器與設(shè)備

HZ.B-81回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖床 普誠(chéng)科技有限公司；PHS-3精密pH計(jì) 上海雷磁儀器廠；TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；BIOTECH-X BS型20L小型發(fā)酵罐、KQ-C型全自控蒸汽發(fā)生器 上海保興生物公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵液制備

采用小型發(fā)酵罐培養(yǎng)桑黃菌絲體，培養(yǎng)基14L，培養(yǎng)溫度28℃，接種量10%，轉(zhuǎn)速200r/min，通氣量14L/min，培養(yǎng)7d。

1.3.2 多糖測(cè)定

發(fā)酵液總糖和還原糖的測(cè)定：總糖測(cè)定采用蒽酮-硫酸法[14]，以葡萄糖為對(duì)照品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，多糖質(zhì)量濃度在0～0.024mg/mL吸光度和總糖質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=19.304C總糖(n=6)，R2=0.9990。式中：A為吸光度；C總糖為總糖的質(zhì)量濃度/(mg/mL)。

還原糖測(cè)定采用3,5-二硝基水楊酸比色法[15]，以葡萄糖為對(duì)照品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，在0～0.6mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，還原糖和吸光度呈良好的線性關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=1.3002C還原糖(n=6)，R2=0.9990。式中：A為吸光度；C還原糖為還原糖的質(zhì)量濃度/(mg/mL)。

粗多糖的含量/(mg/mL)=總糖的含量-還原糖的含量1.3.3 多糖提取基本條件[16]

500mL發(fā)酵全液經(jīng)剪切乳化機(jī)打碎后，用1mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵全液pH值至12，100℃沸水浸提1h，5000×g離心10min，取上清液測(cè)定多糖含量。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

在提取時(shí)間0.5、1、1.5、2、2.5、3h，提取溫度80、85、90、95、100℃，提取pH值為8、9、10、11和12條件下，按照1.3.3節(jié)方法探討提取pH值、提取溫度和提取時(shí)間對(duì)桑黃發(fā)酵液多糖含量的影響。

1.3.5 響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)[17]

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table1 Coded values and corresponding actual values of the optimization parameters used in response surface analysis

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取提取時(shí)間、提取溫度、提取pH值 3個(gè)影響因子(自變量)，采用3因素3水平的響應(yīng)曲面分析方法，分別用X1、X2、X3表示3個(gè)因素，并以＋1、0、-1分別代表變量的水平，按方程Xi=(xi-x0/Δx)對(duì)自變量進(jìn)行編碼(表1)。其中，Xi為變量的編碼值，xi為變量的真實(shí)值，x0為試驗(yàn)中心點(diǎn)變量的真實(shí)值，Δx為變量的變化步長(zhǎng)，多糖含量Y/ (mg/mL)為響應(yīng)值。采用多元回歸設(shè)計(jì)方法，擬合二次多項(xiàng)模型的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)桑黃多糖含量的影響

500mL發(fā)酵全液經(jīng)剪切乳化機(jī)打碎后，在提取溫度100℃、pH12的條件下，考察不同提取時(shí)間對(duì)多糖含量的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 提取時(shí)間對(duì)多糖含量的影響Fig.1 Effect of extraction time on polysaccharide content

由圖1可知，在0.5～1.5h時(shí)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵液多糖含量呈上升趨勢(shì)。當(dāng)提取時(shí)間為1.5h時(shí)，多糖含量最高；但當(dāng)提取時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)時(shí)，發(fā)酵液多糖含量呈不斷下降趨勢(shì)，因此提取時(shí)間以1.5h為宜。

2.1.2 提取溫度對(duì)桑黃多糖含量的影響

500mL發(fā)酵全液經(jīng)剪切乳化機(jī)打碎后，在提取時(shí)間1.5h、pH12的條件下，考察不同提取溫度對(duì)多糖含量的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 提取溫度對(duì)多糖含量的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on polysaccharide content

由圖2可知，隨溫度的升高，發(fā)酵液多糖含量不斷增加，到達(dá)95℃時(shí)多糖含量達(dá)到最高；當(dāng)提取溫度進(jìn)一步增加時(shí)，多糖含量略有下降。提取過程中還發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的升高，還原糖的含量呈上升趨勢(shì)，考慮到高溫可能對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)與活性有一定影響，溫度過高多糖易產(chǎn)生降解，而且溫度過高，增加能耗，所以選擇90～95℃作為提取的最佳溫度。

2.1.3 提取pH值對(duì)桑黃多糖含量的影響

500mL發(fā)酵全液經(jīng)剪切乳化機(jī)打碎后，在提取時(shí)間1.5h、溫度95℃的條件下，考察不同提取pH值對(duì)多糖含量的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 提取pH值對(duì)多糖含量的影響Fig.3 Effect of extraction pH on polysaccharide content

由圖3可知，在提取pH值為8～10時(shí)，隨著pH值的升高，多糖含量上升趨勢(shì)比較平緩；當(dāng)pH值從10升到11時(shí)，多糖含量顯著地升高，趨勢(shì)較陡，這可能是由于強(qiáng)堿性條件加快細(xì)胞壁的破裂，細(xì)胞內(nèi)多糖溶解到發(fā)酵液中所致；當(dāng)pH值進(jìn)一步升高時(shí)，多糖含量呈下降趨勢(shì)，因此選擇提取最佳pH值為11。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化提取條件

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

利用Design-Expert 8.0軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇提取時(shí)間、提取溫度和提取pH值3個(gè)因素所確定的水平范圍，以多糖含量為響應(yīng)值，進(jìn)行3因素3水平，共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析，試驗(yàn)以隨機(jī)次序進(jìn)行[18]，結(jié)果見表2。

圖3 提取pH值對(duì)多糖含量的影響Fig.3 Effect of extraction pH on polysaccharide content

2.2.2 回歸模型建立及方差分析

經(jīng)Design-Expert 8.0軟件對(duì)表2試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，建立二次多項(xiàng)式回歸模型。

表3 回歸方程各項(xiàng)方差分析Table3 Analysis of variance for each term of the fitted regression equation

由表3方差分析可知，該回歸模型顯著。各因素經(jīng)二次多項(xiàng)回歸擬合后，得到二次多項(xiàng)回歸方程：Y=11.51＋0.38X1＋0.70X2＋0.95X3-0.29X1X2-0.32X1X3＋0.33X2X3-0.42X12-1.52X22-0.95X32。提取時(shí)間、提取溫度和提取pH值三個(gè)因素在試驗(yàn)過程中均起主要作用，二次項(xiàng)X22、也是顯著的，但各種因素的交互作用的影響都不顯著，說明各因素之間的交互作用很小；失擬項(xiàng)P=1.13＞0.05，差異不顯著，表明建立的二次多項(xiàng)式回歸模型能運(yùn)用于桑黃發(fā)酵液多糖提取優(yōu)化的理論預(yù)測(cè)；R2=0.9557，說明模型擬合程度良好，試驗(yàn)誤差小，該模型能夠反映響應(yīng)值的變化。

圖4 兩因素及其交互作用響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface plots for the effects of extraction parameters on polysaccharide content

對(duì)表3的結(jié)果作響應(yīng)面分析，見圖4，其中各圖表示X1、X2、X3中任意一個(gè)變量取零水平時(shí)，其余兩個(gè)變量對(duì)多糖提取率的交互影響。由圖4可知，提取pH值是影響桑黃發(fā)酵液多糖含量的最主要因素，提取溫度次之，選擇合適的提取pH值和提取溫度，可獲得較高的提取率。通過軟件分析，預(yù)測(cè)出桑黃發(fā)酵液多糖提取的最優(yōu)工藝水平編碼值，即X1=0.16、X2=0.27、X3=0.52，相當(dāng)于提取時(shí)間1.58h、提取溫度96.35℃、提取pH11.52，在此條件下預(yù)測(cè)多糖含量為11.88mg/mL?？紤]到實(shí)際操作的方便性，將各因素修正為提取時(shí)間1.6h、提取溫度96℃、提取pH12，在修正條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到桑黃發(fā)酵液多糖含量為11.67mg/mL，與預(yù)測(cè)值基本一致，驗(yàn)證了方程的可行性。

3 結(jié) 論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的響應(yīng)面法應(yīng)用于優(yōu)化藥用真菌桑黃活性多糖提取的研究，利用較少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)，獲得最佳優(yōu)化條件。結(jié)果表明：提取時(shí)間、提取溫度和提取pH值對(duì)桑黃多糖含量影響顯著，對(duì)提取過程的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，由此建立的回歸模型擬合程度良好，理論值和預(yù)測(cè)值基本一致，適合工業(yè)化大生產(chǎn)的應(yīng)用。

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Optimization of Extraction Process for Polysaccharides from Phellinus igniarius Fermentation Broth by Response Surface Methodology

LIANG Da-yong，ZHAO Chen，HUANG Fang，SONG Ai-rong*
(Shandong Provincial Laboratory of Applied Mycology, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China)

Response surface methodology was used to optimize main process parameters for the extraction of polysaccharides from Phellinus igniarius fermentation broth based on polysaccharide content of extracts. A regression model equation was fitted. The optimum extraction conditions were found to be pH 12, 96 ℃ and 1.6 h. The extract obtained under these conditions contained 11.67 mg/mL polysaccharides. The fitted regression model had excellent goodness of fit and showed lower prediction error.

Phellinus igniarius；liquid fermentation；polysaccharide；extract；response surface methodology

TS201.1

A

1002-6630(2013)04-0114-04

2012-02-06

山東省科技攻關(guān)項(xiàng)目(2010GNC10956)

梁大勇(1983—)，男，碩士，研究方向?yàn)樗幱谜婢钚晕镔|(zhì)分離純化及藥理活性。E-mail：dayongliang@126.com

*通信作者：宋愛榮(1952—)，女，研究員，本科，研究方向?yàn)槭乘幱镁Y源與育種、應(yīng)用真菌發(fā)酵與有效成分提取。E-mail：airongsong@163.com