董 旭，杜先鋒*

(1.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室(合肥)，安徽 合肥 230022；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽 合肥 230036)

響應(yīng)面法優(yōu)化纖維素酶提取山核桃蒲多酚類物質(zhì)

董 旭1，杜先鋒2,*

(1.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室(合肥)，安徽 合肥 230022；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽 合肥 230036)

利用纖維素酶法提取山核桃蒲多酚，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過SAS統(tǒng)計分析軟件，運用四因素三水平的響應(yīng)面設(shè)計方法，建立纖維素酶法提取山核桃蒲多酚的二次多項數(shù)學(xué)模型，以提取率為響應(yīng)值作響應(yīng)面和等高線，最優(yōu)浸提條件為pH6、浸提溫度70℃、加酶量4U/g底物、浸提時間70min，此時的提取率預(yù)測值為63.43%，實際重復(fù)得出該條件下提取率為61.72%，相對偏差為2.77%。

山核桃蒲；纖維素酶；多酚；提??；響應(yīng)面法

山核桃(Carya cathayensis Sarg.)，又名“小胡桃”、山核桃楸，主要產(chǎn)于皖南山區(qū)海拔300～900m及大別山區(qū)海拔800～1200m的針闊葉混交林中。浙江省天目山區(qū)也有分布，其中臨安縣西部昌化地區(qū)和淳安縣北部有大面積的人工林[1]。山核桃果皮由外果皮、中果皮和內(nèi)果皮三層結(jié)構(gòu)組成，含葉綠體的表皮細(xì)胞緊密排列形成薄壁組織層，外表面有角質(zhì)層，構(gòu)成外果皮即為山核桃蒲，是山核桃加工過程中的廢棄物。山核桃蒲殼與山核桃干子數(shù)量的比例約是4.5:1～5.5:1，據(jù)此可知每年的山核桃蒲殼的量至少可達(dá)30000t以上。每年山核桃采收的季節(jié)，大量的山核桃蒲殼廢棄物堆積如山或直接傾倒在河里，對山區(qū)的自然環(huán)境造成了極大的污染[2-6]。

本研究在超細(xì)粉碎的基礎(chǔ)上采用纖維素酶破壞其細(xì)胞壁[7]，使山核桃蒲殼中的多酚類物質(zhì)充分釋放，結(jié)合二次通用旋轉(zhuǎn)設(shè)計方法，建立以多酚提取率為目標(biāo)函數(shù)的數(shù)學(xué)模型，重點考察溫度、時間、pH值和加酶量對多酚提取率的影響，為山核桃蒲的綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山核桃蒲采自安徽省寧國市；沒食子酸對照品 中國食品藥品檢定研究院；氫氧化鈉、鹽酸、碳酸鈉 上海中試化工總公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 西隴化工股份有限公司；纖維素酶 湖南尤特爾生化有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DK-8D型電熱恒溫水槽 上海恒科科技有限公司；B-290型噴霧干燥機 瑞士Büchi公司；FS-450型超聲處理器 上海生析超聲波儀器有限公司；UV-2102C型紫外-可見光分光光度計 美國尤尼柯儀器有限公司；OPD-8型噴霧干燥機 上海大川原噴霧干燥設(shè)備有限公司；U-3010紫外-可見掃描儀 日本日立公司；HX-200A型高速中藥粉碎機 浙江省永康市溪岸五金藥具廠；RE-522AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 原料預(yù)處理

山核桃蒲洗凈、烘干、經(jīng)中藥粉碎機粉碎后、過篩、密封備用。

1.3.2 山核桃蒲浸提液多酚成分的定性鑒定[8-9]

利用植物多酚的定性鑒定方法鑒定山核桃蒲浸提液中的多酚成分。

1.3.3 多酚含量的測定

采用Folin-Ciocalteu(FC)法[10-11]，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，將100mg沒食子酸對照品置于100mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，配制質(zhì)量濃度1mg/mL的沒食子酸對照品溶液。取1mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液定容至100mL，后分別配制質(zhì)量濃度為10、20、30、40、50μg/mL的沒食子酸對照品溶液，按Folin-Ciocalteu法分別取上述溶液1mL，加入1mL磷鉬鎢酸試劑(現(xiàn)配)，加入8mL 7.5g/100mL的碳酸鈉溶液混勻，40℃保持20min，在765nm[12]處分別測定吸光度并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=4.44X + 0.0038，R2=0.9994。

1.3.4 纖維素酶酶活的測定[13]

1.3.4.1 原理

纖維素酶水解羧甲基纖維素分子中的β-1,4葡萄糖苷鍵，釋放出還原糖(以葡萄糖計)，與3,5-二硝基水楊酸(DNS)反應(yīng)產(chǎn)生顏色變化，顏色的變化程度與釋放還原糖的量呈正比，在550nm測得的吸光度對照標(biāo)準(zhǔn)曲線(以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)物)確定釋放還原糖的量，從而計算出纖維素酶活力。

1.3.4.2 纖維素酶活力單位定義

1g酶粉(1mL酶液)于50℃、pH4.8條件下，每分鐘水解1% CMC溶液產(chǎn)生1μmol還原糖的酶量定義為一個纖維素酶活力單位。

1.3.4.3 酶活計算公式式中：A為在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對應(yīng)的葡萄糖量/(mg/mL)；

D為酶液稀釋倍數(shù)；t為反應(yīng)時間/min；M為葡萄糖相對分子質(zhì)量(180.2)；V為測定用酶液體積/mL。

1.3.5 多酚提取率計算公式

式中：m為每克原料中提取的多酚量/g；M為每克原料中的多酚含量/g。

1.3.6 單因素試驗

考察了溫度、時間、pH值、加酶量以及料液比對多酚提取率的影響，初步確定適宜的浸提條件。

1.3.7 浸提條件的探討

在單因素試驗所確定的適宜條件范圍內(nèi)，采用四因素二次通用旋轉(zhuǎn)設(shè)計，以多酚提取率為響應(yīng)值，通過考察上述4因素對多酚得率的協(xié)同影響來確定最優(yōu)浸提條件，該設(shè)計采用SAS數(shù)據(jù)處理中的響應(yīng)面進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 山核桃蒲浸提液多酚成分的定性鑒定[14-15]

利用多酚類物質(zhì)的理化性質(zhì)，在山核桃蒲浸提液中分別加入明膠、三氯化鐵、甲醛-濃鹽酸、醋酸鉛試劑，根據(jù)加入不同試劑所產(chǎn)生的試驗現(xiàn)象判定浸提液中是否含有多酚類物質(zhì)。

表1 定性分析試驗結(jié)果Table1 Qualitative analysis of peel extract of Carya cathayensis Sarg

如表1所示，5組實驗均呈陽性結(jié)果，可以判定山核桃蒲浸提液中含有多酚類物質(zhì)。

2.2 山核桃蒲原料中多酚類物質(zhì)的含量測定

精確稱取1.0g山核桃蒲原料，加入體積分?jǐn)?shù)50%的丙酮溶液50mL加熱回流2h，過濾，將濾渣再加入50%的丙酮溶液50mL加熱回流2h，如此反復(fù)至濾液中無多酚物質(zhì)浸出，合并濾液，減壓蒸餾除去丙酮后經(jīng)Folin-Ciocalteu法測定，濾液中的多酚類物質(zhì)為81.1mg，即山核桃蒲原料中多酚類物質(zhì)的含量為8.1%。

2.3 纖維素酶活力測定

取3支25mL的刻度試管分別加入0.2mL的稀釋酶液，再分別加入1.8mL CMC溶液，50℃水浴加熱30min后加入DNS試劑2mL，搖勻后具塞，沸水水浴10min，冷卻后于550nm波長處測定吸光度，從葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計算還原糖的量[16]，帶入纖維素酶活力計算公式，計算出纖維素酶實測活力為1530U/g。

2.4 不同提取方式下提取效果的對比

精確稱取10g已粉碎的山核桃蒲原料，在浸提溫度60℃、料液比1:10、浸提時間1h的基本條件下，分別考察了超聲波輔助浸提(超聲波功率為450W，超聲處理方式為連續(xù)脈沖，處理時間1h)，酶法浸提(pH5.5；加酶量為：纖維素酶3U/g底物、果膠酶1U/g底物)及超聲波輔助酶法浸提等提取方式，按照1.3.2節(jié)的測定步驟以吸光度為判定依據(jù)。見表2。

表2 不同提取方式對多酚物質(zhì)提取效果的影響Table2 Effect of extraction methods on the extraction efficiency of polyphenols

由表2可以得出，纖維素酶的使用可以大大提高多酚物質(zhì)的溶出量，在超聲波輔助下的溶出量與單獨使用纖維素酶時基本相當(dāng)，綜合考慮本實驗選用纖維素酶法進(jìn)行山核桃蒲多酚浸提。

2.5 單因素試驗

以10g山核桃蒲為原料，考察溫度、時間、pH值、加酶量以及料液比這5個因素對試驗結(jié)果的影響，通過只改變一個因素，來比較各因素的浸提條件的范圍。

2.5.1 浸提溫度的選擇

由于纖維素酶的適宜反應(yīng)溫度為40～70℃，因此選擇40～80℃為溫度單因素考察的范圍。由圖1可知，在60℃時多酚的提取率最高。在溫度40℃～60℃時提取率隨溫度的升高而逐漸提高，當(dāng)溫度高于60℃時提取率卻隨溫度的升高而逐漸下降，這說明隨著溫度的升高，酶的活性降低，同時過高的溫度也會對已溶出的多酚類物質(zhì)起到破壞的作用。

圖1 浸提溫度對多酚提取率的影響Fig.1 Effect of temperature on the extraction efficiency of polyphenols

2.5.2 浸提時間的選擇

圖2 浸提時間對多酚提取率的影響Fig.2 Effect of hydrolysis time on the extraction efficiency of polyphenols

在確定了浸提溫度60℃的基礎(chǔ)上，考察5個時間點對提取率的影響。由圖2可知，多酚的提取率隨時間的延長而逐漸增加，在30～60min時間段內(nèi)提取率的增速極快，在60～120min時間段內(nèi)提取率平穩(wěn)增長，而從120min后提取率的增長量基本不變。因此選擇浸提時間為120min。

2.5.3 pH值的選擇

在確定了浸提溫度60℃、浸提時間90min的基礎(chǔ)上，同時考慮到纖維素酶反應(yīng)的適宜pH值，選擇5個pH值，考察5個不同pH值對提取率的影響。由圖3可知，pH值為5～5.5范圍時，提取率達(dá)到最高值，pH＞5.5時，提取率開始下降，到6.5時，趨于平穩(wěn)，因此選擇pH5.5作為較適酸度。

圖3 pH值對多酚提取率的影響Fig.3 Effect of hydrolysis pH on the extraction efficiency of polyphenols

2.5.4 加酶量對提取率的影響

在確定了浸提溫度60℃、浸提時間90min、pH5.5的基礎(chǔ)上，考察5個不同加酶量對提取率的影響。由圖4可知，加酶量在3U/g底物時提取率最高，1～3U/g底物時反應(yīng)體系中底物充足，增長速度較快，4U/g底物以后提取率有所下降，這時酶解反應(yīng)飽和，反應(yīng)速率將不再增加反而會逐漸下降，使得酶有效利用率下降，所以選擇纖維素酶用量選擇3U/g底物。

圖4 加酶量對多酚提取率的影響Fig.4 Effect of enzyme loading on the extraction efficiency of polyphenols

2.5.5 料液比對提取率的影響

在確定了浸提溫度60℃、浸提時間90min、pH5.5、加酶量3U/g底物的基礎(chǔ)上，考察5個不同料液比對提取率的影響。由圖5可知，當(dāng)料液比達(dá)到1:12時多酚的提取率最大，且從1:12開始提取率基本趨于穩(wěn)定，因此選擇料液比為1:12。

圖5 料液比對多酚提取率的影響Fig.5 Effect of solid-to-liquid ratio on the extraction efficiency of polyphenols

2.6 試驗設(shè)計及響應(yīng)面分析

2.6.1 試驗設(shè)計

圖5 料液比對多酚提取率的影響Fig.5 Effect of solid-to-liquid ratio on the extraction efficiency o polyphenols

表4 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table4 Quadratic universal rotation combination design matrix and results

依據(jù)單因素試驗結(jié)果，綜合考慮各因素對山核桃蒲多酚提取率的影響，采用二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計法，以多酚提取率為響應(yīng)值，對pH值、溫度、加酶量和時間這4個因素優(yōu)化設(shè)計，試驗安排及結(jié)果如表3、4所示。

2.6.2 響應(yīng)曲面法試驗

表5 提取率的回歸數(shù)學(xué)模型Table5 Regression coefficients and statistical significance of the fitted regression model

表6 模型方差分析Table6 Analysis of variance for the fitted regression model

響應(yīng)曲面法試驗設(shè)計及結(jié)果見表4，運用SAS數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，回歸模型系數(shù)及顯著性檢驗結(jié)果見表5。得到pH值(X1)、浸提溫度(X2)、加酶量(X3)、浸提時間(X4)的二次多項回歸模型：

響應(yīng)數(shù)據(jù)的方差分析結(jié)果見表6，分析結(jié)果顯示模型的F值=13.931＞F0.05(14,6)=2.85，P=0.0001＜0.01，表明回歸模型顯著，故可用上述回歸方程描述各因子與響應(yīng)值之間的關(guān)系(R2=92.42%)。由表5可知方程X1、X2、X3影響極顯著，X4影響顯著，且由表6可知，二次項極顯著(P＜0.001)，說明響應(yīng)面分析所選的主效應(yīng)都達(dá)到顯著水平。其中，因素之間的交互作用也較大(P＜0.05)。同時由F值和P值可以看出，在pH值、浸提溫度、加酶量、浸提時間這4個因素中，pH值、浸提溫度、加酶量對提取率影響最大，其次是浸提時間。失擬項F=0.829＜F0.05(14,10)=2.60，P=0.0858＞0.05，不顯著，說明該模型擬合程度良好，試驗誤差小，可以用此模型來分析和預(yù)測山核桃蒲多酚提取的工藝結(jié)果。模型的響應(yīng)曲面及等高線見圖6、7，兩組圖直觀地反映了各因素對響應(yīng)值的影響。

圖6 pH值、加酶量對多酚提取率的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots for the effect of pH and enzyme loading on the extraction efficiency of polyphenols

圖7 溫度、加酶量對多酚提取率的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots for the effect of temperature and enzyme loading on the extraction efficiency of polyphenols

2.6.3 浸提最佳條件優(yōu)化與驗證

運用SAS軟件的響應(yīng)曲面優(yōu)化設(shè)計對試驗結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化，考慮到實際生產(chǎn)中的條件，選擇最優(yōu)浸提條件為pH6、浸提溫度70℃、加酶量4U/g底物、浸提時間70min，預(yù)測山核桃蒲多酚的提取率為63.43%。

為檢測響應(yīng)曲面法所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化條件進(jìn)行重復(fù)實驗，在上述條件下實際提取率為61.72%。與預(yù)測值相比，其相對偏差約為2.77%，說明可以利用上述回歸方程對實際浸提進(jìn)行預(yù)測和控制。因此，基于響應(yīng)曲面法所得的優(yōu)化工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實用價值。

3 結(jié) 論

試驗結(jié)果表明在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用SAS統(tǒng)計分析中的二次通用旋轉(zhuǎn)組合，進(jìn)行響應(yīng)面分析，建立了山核桃蒲多酚提取工藝中pH值、溫度、加酶量和浸提時間對提取率的數(shù)學(xué)模型。通過方差和可信度分析表明，模型擬合度較好。通過響應(yīng)面優(yōu)化分析，確定最優(yōu)浸提條件為pH6，浸提溫度70℃、加酶量4U/g底物、浸提時間70min，預(yù)測山核桃蒲多酚的提取率為63.43%。實際重復(fù)得出該條件下實際提取率為61.72%。與預(yù)測值相比，其相對偏差約為2.77%。在最優(yōu)浸提條件下的驗證試驗表明，建立的數(shù)學(xué)模型可以完全模擬山核桃蒲多酚的提取過程。

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Optimization of Cellulase-Assisted Extraction of Polyphenols from Carya cathayensis Sarg Peels by Response Surface Methodology

DONG Xu1，DU Xian-feng2,*
(1. Key Laboratory of Agro-Product Safety Risk Evaluation (Hefei), Ministry of Agricultrue, Institute of Plant Protection and Agro-Products Safety, Anhui Academy of Agricultural Sciences, Hefei 230022, China；2. College of Tea & Food Science and Technology, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China)

Response surface methodology was employed to optimize the cellulase-assisted extraction of polyphenols from Carya cathayensis Sarg peels. A regression model was established based on a four-variable, three-level quadratic universal rotation combination design using SAS software. Response surface and contour plots were drawn for the extraction efficiency of polyphenols as a function of four operating parameters. The optimum extraction conditions were found to be pH 6, 70 ℃, 70 min and4 U/g for enzyme loading. Under the optimized conditions, the maximum predicted extraction efficiency of polyphenols was 63.43%, which was close to the actual average value of 61.72% with a relative error of 2.77%.

Carya cathayensis Sarg peels；cellulase；polyphenol；extraction；response surface methodology

TQ243.1

A

1002-6630(2013)04-0109-05

2012-02-08

董旭(1979—)，男，碩士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估。E-mail：dongxu929@163.com

*通信作者：杜先鋒(1963—)，男，教授，博士，研究方向為食品生物技術(shù)及農(nóng)副產(chǎn)品深加工。E-mail：dxf@ahau.edu.cn