張 鏡，朱明睿，刁樹平

(嘉應(yīng)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東 梅州 514015)

陰香果實主要生物活性成分的提取工藝

張 鏡，朱明睿，刁樹平

(嘉應(yīng)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東 梅州 514015)

研究陰香果實花色苷、原花青素及果膠的提取技術(shù)，以對其進(jìn)行綜合利用。以水為溶劑、5W/mL超聲波處理，經(jīng)單因素試驗及正交試驗表明，同時提取陰香果實3種活性成分的最佳條件為pH1、液料比13(mL/g)、50℃浸泡60min、5W/mL超聲90s，經(jīng)2次提取花色苷、原花青素及果膠提取率分別為92.55%、95.65%及96.51%。DM301樹脂與提取液以1:40比例混合，花色苷及原花青素的吸附率分別為94.58%和96.63%，解吸率分別為96.47%和94.66%。以體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇溶液、1BV/h流速動態(tài)洗脫，洗脫峰體積為柱床體積的40%，花色苷和原花青素的洗脫率分別為92.23%與93.11%。結(jié)果表明水為溶劑、經(jīng)超聲波處理及樹脂分離是同時提取陰香果實3種活性成分的有效方法。

陰香；果實；原花青素；花色苷；果膠；提取工藝

陰香(Cinnamomum burmannii)屬樟科、樟屬，多年生常綠喬木，長勢旺，抗逆性強，在我國主要分布于廣東、福建等地，是華南地區(qū)的優(yōu)良行道樹種與良好的生態(tài)樹種。陰香也是多用途的經(jīng)濟(jì)林木，樹皮、葉、果實可提取藥用成分與制造香精、肥皂等的化工原料，也可提取對多種植物病原菌具有抑菌活性的物質(zhì)[1]，陰香材質(zhì)細(xì)膩，是家具、建筑及室內(nèi)裝飾等用的優(yōu)良木材。陰香樹的結(jié)果率高、果實產(chǎn)量大，成熟果實果皮紫黑色，富含花色苷、原花青素、果膠、粗脂肪等多種成分[2]。

花色苷不僅因顏色鮮艷、食用安全而廣泛用作食品、藥品及化妝品的著色劑[3]，亦因有很強的自由基清除、抗氧化活性等多種醫(yī)療保健功能，為保健品中重要的功能性成分[4]。原花青素是清除自由基、抗氧化活性更強，醫(yī)療保健作用更突出的天然活性物質(zhì)[5-11]。果膠系植物活性多糖，不僅具有醫(yī)療保健功能，還可螯合鍶、鎘等重金屬形成惰性化合物隨糞便排出體外消除重金屬的危害，果膠還可用作醫(yī)藥凝膠劑、食品增稠劑等[12-15]。

陰香果實成分復(fù)雜，活性成分的開發(fā)利用必須去除油脂，此外果實內(nèi)果膠的吸水性強，有礙花色苷與原花青素的提取分離。目前，除筆者曾研究過陰香鮮果果肉花色苷的提取工藝外[16]，尚未見從陰香干果中同時提取3種主要活性物質(zhì)的報道。因此研究陰香果實活性成分經(jīng)濟(jì)有效的提取技術(shù)，對大量廢棄陰香果實高價值成分的資源化利用具有積極的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

成熟陰香果實采摘自廣東省梅州市，除去病果、傷果，蒸餾水清洗果面塵土，晾干果面余水，冷凍干燥，粉碎，石油醚回流除脂，減壓除凈石油醚，再次粉碎，80篩目過篩，粉末物料冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

無水甲醇、無水乙醇、硫酸、苯酚、正丁醇、鹽酸、硫酸鐵銨均為分析純；吸附樹脂DM301、AB-8、NKA9、DA201、DS401、NKA-Ⅱ、D107 天津樹脂廠。

1.2 儀器與設(shè)備

YJ92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎儀 寧波市鄭州通杰實驗儀器有限公司；JLL28-B 低速大容量離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；BT2K XL 凍干機 美國VirTis公司；U-2800 紫外-可見分光光度計 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 提取效果測定

1.3.1.1 花色苷的測定

取適量提取液與無水乙醇按體積比1:5的比例混勻，20min后4℃、9000r/min離心20min，測定上清液于515nm波長處的吸光度，以吸光度為各處理花色苷提取效果的指標(biāo)。測定不同pH值與花色苷提取效果的關(guān)系時，各處理提取液先調(diào)pH值為4，再測上清液于515nm波長處的吸光度。

1.3.1.2 原花青素的測定

取適量提取液與無水乙醇按1:5比例混勻，靜置20min，4℃、9000r/min離心20min，收集清液凍干，蒸餾水定容得提取液。提取液1mL，加6mL體積比為95:5的正丁醇-鹽酸溶液及0.2mL 2%硫酸鐵銨混勻，沸水浴40min后水浴至室溫，測定其于550nm波長處的吸光度(A2)[17]。取1mL提取液加6.2mL蒸餾水，沸水浴40min后冰水冷卻至室溫，測定其于550nm波長處的吸光度(A1)，各處理以A2與A1的差值作為評價原花青素提取效果的標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.1.3 果膠的測定

取適量提取液與無水乙醇按1:5比例混勻，靜置20min，4500r/min離心20min，沉淀加1.0mL 5%苯酚溶液及5.0mL濃硫酸，迅速混勻，室溫放置30min后測定其于490nm波長處的吸光度[18]。

1.3.2 超聲波處理提取陰香果實活性成分

1.3.2.1 液料比對活性成分提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取適量物料，按不同液料比(mL/g)加入蒸餾水，浸泡(同時攪拌)20min后室溫放置1h，5W/mL超聲波處理90s，4500r/min離心20min，取上清液測定液花色苷、原花青素及果膠的吸光度。

1.3.2.2 超聲波處理時間對活性成分提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取適量物料，按液料比13(mL/g)與蒸餾水混勻，浸泡(同時攪拌)20min后室溫放置1h，5W/mL超聲波處理不同時間，4500r/min離心20min，取上清液測定花色苷、原花青素及果膠的吸光度。

1.3.2.3 pH值對活性成分提取效果的影響

以HCl及NaOH調(diào)蒸餾水為不同的pH值，將物料與不同pH值的蒸餾水按液料比13(mL/g)混勻，浸泡(同時攪拌)20min后室溫放置1h，超聲波處理90s，4500r/min離心20min，取上清液測定花色苷、原花青素及果膠的吸光度。

1.3.2.4 溫度對活性成分提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取適量物料，按液料比13(mL/g)與蒸餾水混勻，浸泡(同時攪拌)20min后分別在不同溫度下水浴處理1h，5W/mL超聲波處理90s，4500r/min離心20min，取上清液測定花色苷、原花青素及果膠的吸光度。

1.3.2.5 浸泡時間對提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取適量物料，按液料比13(mL/g)與蒸餾水混勻，浸泡(同時攪拌)不同時間后室溫放置1h，5W/mL超聲波處理90s，4500r/min離心20min，取上清液測定花色苷、原花青素及果膠的吸光度。

1.3.2.6 提取參數(shù)的正交試驗優(yōu)化

稱取適量物料，以液料比、溫度、超聲波處理時間及溶液pH值進(jìn)行4因素3水平L9(34)的正交試驗，試驗先將物料與相應(yīng)pH值的蒸餾水及液料比混合、相應(yīng)溫度浸泡60min，再以5W/mL超聲波處理不同時間，4500r/min離心20min，取上清液測定提取液花色苷、原花青素及果膠的吸光度。

1.3.2.7 提取次數(shù)對活性成分提取率的影響

稱取適量物料，以13(mL/g)的液料比與pH1的蒸餾水混勻，攪拌20min，50℃水浴1h后5W/mL超聲波處理90s，4500r/min離心20min，取上清液測定花色苷、原花青素及果膠的吸光度，提取次數(shù)5次，分別測定不同次數(shù)提取液吸光度，以5次提取吸光度的總和為100%提取率，各次提取的提取率為其吸光度占總吸光度的百分比。

1.3.3 陰香果實提取液活性成分的分離

1.3.3.1 提取液活性物質(zhì)的樹脂分離

供試大孔吸附樹脂與提取液按1:40(m/V)的比例混合，振蕩器28℃、150r/min靜態(tài)吸附12h，分離樹脂。提取液吸附前、后測定花色苷、原花青素及果膠吸光度，參考文獻(xiàn)資料[2]計算供試樹脂對3種物質(zhì)的吸附率。準(zhǔn)確稱適量樹脂與體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液按1:20(m/V)的比例混合，150r/min靜態(tài)解吸12h后測定解吸液花色苷、原花青素的吸光度，計算解吸率。

1.3.3.2 樹脂吸附成分的動態(tài)解吸

將1.3.3.1節(jié)分離的樹脂以1倍體樹脂體積的蒸餾水漂洗2min，取100mL裝入層析柱，以80%乙醇溶液、流速1BV/h解吸，以10mL為1流份收集解吸液，分別測定各流份解吸液中花色苷及原花青素的吸光度，對高濃度的洗脫液先稀釋，使其吸光度在0.1～1.0之間。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

各處理重復(fù)3次，試驗數(shù)據(jù)平均值以Excel 作圖，用SPSS 11.0進(jìn)行方差分析，相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行Duncans’差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 液料比對活性成分提取效果的影響

圖1 料液比對活性成分提取效果的影響Fig.1 Effect of liquid/solid ratio on the extraction efficiency of active substances

由圖1可知，花色苷、原花青素及果膠的提取效果均隨液料比的增大相應(yīng)提高，當(dāng)液料比為13(mL/g)時提取效果較小于13(mL/g)的差異極顯著(P＜0.001)，液料比大于13(mL/g)后提取液的吸光度間無顯著差異(P＜0.05)，結(jié)果表明同時提取陰香果實3種物質(zhì)的液料比以13(mL/g)為佳。此液料比較多種植物花色苷或原花青素提取的稍高，主要是因陰香果膠吸漲力大，待充分吸水后超聲波處理方可充分液化，若加水不足，膠體液化程度較低，則會有礙花色苷與原花青素的溶解，從而影響提取效果。

2.2 超聲波處理時間對活性成分提取效果的影響

圖2 超聲波處理時間對活性成分提取效果的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on the extraction efficiency of active substances

由圖2可知，超聲波處理時間在30～90s范圍內(nèi)提取液花色苷的吸光度隨時間延長而增大，處理時間大于90s后提取液的吸光度不再增大。超聲波處理時間對原花青素提取效果的影響趨勢與花色苷較接近，當(dāng)處理時間為90s時的吸光度最大，但大于90s的吸光度未明顯降低。處理時間為60s時果膠的吸光度最大，再延長超聲波處理時間提取效果無明顯變化。因此，同時提取陰香果實3種活性成分，超聲波處理時間60～90s為佳。

2.3 溶液pH值對活性成分提取效果的影響

圖3 pH值對活性成分提取效果的影響Fig.3 Effect of solvent pH on the extraction efficiency of active substances

由圖3可知，溶液pH1～4時花色苷提取效果較好，pH2效果最好，pH＞4時，隨著pH值的上升花色苷提取效果逐漸降低，文獻(xiàn)報道花色苷提取多以pH3～4為最佳，本實驗結(jié)果與之有明顯差異，可能因本實驗提取溶液為純水，在無有機溶劑的條件下酸度較高的溶液對細(xì)胞膜的破壞作用更大，利于胞內(nèi)花色苷的溶解。溶液pH值為3時原花青素提取效果最好，pH＞3時提取效果顯著下降。pH值為1～2提取液果膠的吸光度高，pH＞2提取效果無顯著差異，文獻(xiàn)資料報道植物果膠提取一般適宜的溶液pH值為1～2[22]。試驗表明，提取陰香果實3種活性成分以pH1～3為宜。

2.4 溫度對活性成分提取效果的影響

圖4 溫度對活性成分提取效果的影響Fig.4 Effect of temperature on the extraction efficiency of active substances

由圖4可知，60℃加熱提取高花色苷的效果最好，高于60℃提取液的吸光度有所下降。原花青素提取在50℃時的吸光度已獲很好的效果，50～90℃的提取液的吸光度間無顯著差異，文獻(xiàn)報道的原花青素提取以40～50℃為佳。在80～90℃條件下花色苷與原花青素的提取沒顯著下降，可能是其熱穩(wěn)定性較好，或是果實中的果膠對其具一定的保護(hù)作用。40℃提取液中果膠的吸光度達(dá)最大，高于40℃處理提取液的吸光度與40℃提取的無顯著差異。試驗表明40～60℃內(nèi)3種目的物的提取效果較理想。

圖5 浸泡時間對活性物質(zhì)提取效果的影響Fig.5 Effect of immersion time on the extraction efficiency of active substances

2.5 浸泡時間對提取效果的影響由圖5可知，經(jīng)60min浸泡花色苷及原花青素的吸光度達(dá)最大，果膠提取效果則是40min最佳。結(jié)果表明3種成分經(jīng)40～60min浸泡即可，此時間較多種植物原花青素等成分提取的時間短，可能與陰香果實內(nèi)含大量脂類與果膠的特殊性有關(guān)，除脂的物料水易滲入胞內(nèi)，對水親和力強的果膠在較短時間內(nèi)充分吸水，果膠吸水的膨壓對細(xì)胞結(jié)構(gòu)具有破壞作用，有利于花色苷與原花青素的提取。

2.6 提取參數(shù)的正交試驗優(yōu)化

表1 正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table1 Orthogonal array design matrix and results

由表1可知，花色苷提取效果影響較大的是超聲波處理時間及溫度，因花色苷存在于幾乎無果膠的果肉中[2]，當(dāng)超聲波處理使細(xì)胞破裂后就容易溶出；原花青素和果膠提取以超聲波及液料比的影響較大，因原花青素和果膠都主要存在于果核[2]，超聲波既破裂細(xì)胞結(jié)構(gòu)，又使果膠液化，而液料比影響果膠的吸水。由表1亦可知花色苷、原花青素及果膠提取效果最好的參數(shù)組合分別為A2B2C2D2、A2B2C2D3及A1B2C2D3，3個組合中均含B2C2，即對3種成分提取的影響一致。A因素中花色苷及原花青素提取以A2最佳，分別比A1和A3的吸光度高4.65%及5.23%，而A1提取果膠的吸光度比A2高11.99%。D因子中花色苷提取以D2為佳，另2種成分則以D3為佳，但D3提取液的吸光度均略大于D2，從同時提取3種成分獲得更佳的效果與降低后續(xù)的分離、干燥費用綜合考慮，認(rèn)為以采用A1B2C2D2的參數(shù)組合更為適宜，即溶液的pH值為1、提取溫度50℃、超聲波處理時間90s和13(mL/g)的液料比。

2.7 提取次數(shù)對活性成分提取率的影響由表2可知，經(jīng)2次提取后花色苷、原花青素及果膠的累計提取率分別為92.55%、95.65%和96.51%，表明陰香果實中3種活性成分經(jīng)2次提取的提取率已經(jīng)很高，實際應(yīng)用的提取次數(shù)以2次提取即可。

表2 3種活性成分不同提取次數(shù)的累計提取率Table2 Effect of number of extractions on the extraction efficiency of active substances %

2.8 提取液活性成分的分離

2.8.1 樹脂種類對提取液中活性成分的分離效果

表3 供試樹脂對活性成分的吸附效果Table3 Comparison of adsorption and desorption efficiencies of anthocyanins, proanthocyanidins and pectin on different types of macroporous resin %

由表3可知，靜態(tài)吸附對提取液中花色苷吸附率較高的樹脂有DM301、D107和AB-8，對原花青素吸附率較高的樹脂為DM301、D107及NKA-Ⅱ，其中DM301對原花青素的吸附作用最強。對花色苷及原花青素解吸率均較高的為DM301及D107。供試樹脂對果膠都無明顯的吸附，雖然吸附后液果膠的吸光度有所下降，但這種結(jié)果可能系樹脂表面附著，而非真正吸附的所致。綜合結(jié)果表明，DM301對花色苷及原花青素的吸附與解吸率均高，是提取液中分離花色苷及原花青素較理想的樹脂，而吸附后液經(jīng)濃縮、醇沉可得較高純度的果膠[2]。

2.8.2 DM301樹脂吸附原花青素及花色苷的洗脫效果

圖6 DM301上花色苷及原花青素的洗脫效果Fig.6 Desorption curves of anthocyanins and proanthocyanidins on DM301 resin column

由圖6可知，前洗脫的3流份(每流份體積為柱床體積的10%)中花色苷及原花青素的含量很少，第4～7流份(40%柱床體積的洗脫液)內(nèi)為花色苷和原花青素的解吸高峰，從4～7流份內(nèi)的高峰洗脫液中花色苷和原花青素吸光度分別為140mL洗脫體積液總吸光度的92.23%與93.11%。結(jié)果表明，不僅DM301吸附的2種物質(zhì)的動態(tài)解吸率高，而且解吸峰時間接近。

3 討 論

3.1 研究表明陰香干果物料中同時提取花色苷、原花青素和果膠3種活性物質(zhì)以水為溶劑，提取前溶劑與物料混合室溫浸泡、攪拌20min，主要參數(shù)經(jīng)正交優(yōu)化結(jié)果溶液pH值為1、50℃浸泡60min、液料比13(mL/g)及功率5W/mL超聲波處理時間90s的參數(shù)組合為佳，2次提取后獲較高的提取率。提取液中花色苷及原花青素以DM301樹脂靜態(tài)吸附，再以80%乙醇溶液動態(tài)解吸花色苷及原花青素，干燥后得花色苷及原花青素的精制混合物。提取液的吸附后液經(jīng)蒸發(fā)濃縮，高濃度乙醇沉淀，收集沉淀可得純度較高的果膠。

3.2 陰香果實含大量的脂類物質(zhì)，果肉內(nèi)脂的融點約10℃、果核中脂的熔點45℃左右[2]，從陰香干果實中提取3種活性物質(zhì)應(yīng)先除盡脂類物質(zhì)。果實先初步粉碎，破碎率越高越好，而粒徑大小不重要，物料50～60℃溫度壓榨除脂，然后再除去物料內(nèi)的殘脂，再粉碎，過篩粉末物料方可用于提取3種活性成分。油脂的去除應(yīng)徹底，否則影響提取效果。

目前植物活性成分的提取多采用有機溶劑提取，但陰香果實物料中果膠的含量高，以較高濃度的有機溶劑提取，不僅果膠不能溶解，反而阻礙花色苷及原花青素難以滲出，有機溶劑提取不可行。即使降低有機溶劑濃度、增大液料比后可使3種目的物質(zhì)溶出，但吸附樹脂分離花色苷及原花青素前需先除去其中的有機溶劑，致使提取的費用大幅增加。植物活性物質(zhì)有用超臨界萃取的報道[19-20]，而陰香果實中有花色苷、原花青素及果膠3種不同類型的物質(zhì)，超臨界萃取難以同時提取3種物質(zhì)，以純水提取陰香干果活性成分為適。

陰香果實內(nèi)果膠吸收數(shù)十倍體積水后仍為膠狀，難以進(jìn)行固液分離。果膠適當(dāng)吸水后經(jīng)超聲波處理使果膠液化不僅有利于固液分離，而且超聲波能使細(xì)胞破裂、促進(jìn)胞內(nèi)花色苷與原花青素等物質(zhì)的溶解，若不經(jīng)超聲波處理就難以進(jìn)行陰香果實成分的提取。超聲波在植物產(chǎn)物如黃酮類、果膠等的提取上有較廣泛的應(yīng)用，但多是利用破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、促進(jìn)胞內(nèi)物質(zhì)溶出的作用[21-22]，而用于使膠體液化顯著降低天然產(chǎn)物提取的液料比未見報道。

果膠等多糖是具重要生理活性的天然產(chǎn)物，活性強弱與分子大小有著密切的關(guān)系，一般黏度大的活性較低。超聲波處理淀粉具有非隨機降解性等優(yōu)點，而且不同強度超聲波處理作用性質(zhì)也有差異，特定功率超聲波處理所后數(shù)均分子質(zhì)量趨于一個固定值，分子質(zhì)量分布在一個相對窄的范圍[23]。超聲波處理使陰香果膠的分子質(zhì)量降低、溶解度增大，活性可能比未處理的更高，但其處理功率大小、處理時間等與果膠處理后成分活性的關(guān)系有待深入研究。

樹脂分離提取液中的花色苷及原花青素以大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附為宜。樹脂分離時不宜采用動態(tài)吸附，動態(tài)吸附可能有較多的較小分子果膠進(jìn)入孔內(nèi)，而解吸使用的有機溶劑會致果膠絮凝，影響樹脂的重復(fù)使用。另外，靜態(tài)吸附后的樹脂上柱前應(yīng)以適量清水漂洗，否則上柱后樹脂表面附著的果膠與解吸液接觸后絮凝沉積在樹脂上亦影響著樹脂的重復(fù)使用。

3.3 本工藝技術(shù)提取陰香花色苷及原花青素，以水為溶劑，提取液直接以樹脂分離與精制。另外，工藝所用DM301樹脂對花色苷與原花青素的吸附率和解吸率均高，且?guī)缀跬瑫r被洗脫，洗脫液用量少，干燥過程的費用較低。因此，與目前同類物質(zhì)提取常用技術(shù)相比，本工藝技術(shù)在節(jié)能、減排、降低成本方面具有明顯優(yōu)勢。

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Extraction of Bioactive Substances from Cinnamonmum burmannii Fruits

ZHANG Jing，ZHU Ming-rui，DIAO Shu-ping

(College of Life Science, Jiaying University, Meizhou 514015, China )

An ultrasonic-assisted aqueous extraction method was proposed to simultaneously extract anthocyanins, proanthocyanidins and pectin from C. burmannii fruits. One-factor-at-a-time method combined with orthogonal array design was used to optimize the extraction process. The optimum extraction conditions were found to be immersion in pH1 acidic water at 50 ℃ for 60 min with a water/solid ratio of 13:1 (mL/g) followed by two cycles of ultrasonic treatment at a power of5 W/mL for 90 s. The extraction yields of anthocyanins, proanthocyanidins and pectin under the optimized conditions were 92.55%, 95.65% and 96.51%, respectively. When the resulting extract was mixed with DM301 resin at a ratio of 1:40, the adsorption and desorption rates were 94.58% and 96.47% for anthocyanins and 96.63% and 94.66% for proanthocyanidins, respectively. In dynamic desorption experiments, the desorption rates of anthocyanins and proanthocyanidins were 92.23% and 93.11%, respectively under the conditions of 80% ethanol as the desorbent,1 BV/h desorption flow rate, and 40% desorption volume (relative to the bed volume). The results of this study suggest that ultrasonic-assisted aqueous extraction and separation by macroporous resin chromatography can allow simultaneous extraction and separation of anthocyanins, proanthocyanidins and pectin from C. burmannii fruits.

C. burmannii；fruit；proanthocyanidin；anthocyanins；pectin；extraction process

Q946.836

A

1002-6630(2013)04-0065-06

2012-06-24

廣東省科技計劃項目(2009B011300015)

張鏡(1957—)，男，教授，碩士，研究方向為天然產(chǎn)物與應(yīng)用微生物。E-mail：zhangcqf@jyu.edu.cn