宋 容，肖 覺(jué)

（重慶市腫瘤研究所病理科 400030）

淋巴結(jié)切片常規(guī)HE染色的制片方法一直是病理技術(shù)的難題［1］，其原因除淋巴結(jié)病變本身的復(fù)雜性外，主要還是由于切片質(zhì)量較差所致。質(zhì)量差的淋巴結(jié)切片比其他組織更容易造成假象而導(dǎo)致誤診。淋巴結(jié)病理診斷誤診率高達(dá)10%～30%，其中切片因素占多數(shù)［2］。淋巴結(jié)切片的制片必須遵循“薄切、淡染”的原則。按常規(guī)方法難以制作出優(yōu)質(zhì)淋巴結(jié)切片，為了克服淋巴結(jié)制片時(shí)經(jīng)常出現(xiàn)裂痕、皺褶、破碎，染色過(guò)深或過(guò)淺等問(wèn)題。作者經(jīng)過(guò)多年的臨床實(shí)踐，總結(jié)出了一些優(yōu)質(zhì)淋巴結(jié)切片的制片經(jīng)驗(yàn)和體會(huì)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 本院2011年1月至2012年12月淋巴結(jié)活檢標(biāo)本50例。

1.2 試劑 改進(jìn)的B-5固定液［3］［（1）1%鞣酸1mL；（2）95%乙醇加8g水楊酸80mL；（3）甲醛15mL，3種液體混合配制成100mL后，取B-5液66mL加入甲醇480mL和氯仿240 mL混合，再加入醋酸80mL］。蘇木精（hematoxylin）染色液、伊紅（eosin）染色液、乙醇、硬脂酸、石蠟、0.5%～1.0%鹽酸乙醇、二甲苯。

1.3 方法

1.3.1 固定 改進(jìn)前常規(guī)淋巴結(jié)組織標(biāo)本采用10%甲醛固定液，改進(jìn)后淋巴結(jié)標(biāo)本采用改進(jìn)的B-5固定液。

1.3.2 取材 淋巴結(jié)取材大小1.0cm×1.0cm×0.3cm，取材要規(guī)范，取材刀要鋒利，避免組織擠壓，發(fā)生嚴(yán)重變性。

1.3.3 脫水 選用乙醇脫水效果最佳，從低濃度到高濃度乙醇脫水，脫水要徹底，脫水時(shí)間要嚴(yán)格控制。

1.3.4 透明及浸蠟 改進(jìn)前用二甲苯透明劑石蠟浸蠟，改進(jìn)后用硬脂酸和石蠟的混合液替代二甲苯透明劑。

1.3.5 包埋切片 硬蠟包埋，切片厚度2.5～3.0μm為宜，裱片，展片，烤片。

1.3.6 染色 蘇木精染液染色時(shí)間短，流水沖洗，0.5%～1.0%鹽酸乙醇分化，熱水返藍(lán)，伊紅染色數(shù)秒，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。

2 結(jié) 果

對(duì)50例淋巴結(jié)活檢標(biāo)本HE切片的制片技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，獲得了良好效果。與舊方法相比，采用該方法制作淋巴結(jié)切片，組織結(jié)構(gòu)形態(tài)更完整，切片無(wú)皺褶，無(wú)刀痕，厚薄均勻，組織無(wú)擠壓。鏡下折光率強(qiáng)、胞質(zhì)胞核著色分明，淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)清晰，皮質(zhì)、髓質(zhì)充分展現(xiàn)，淋巴濾泡清晰，色彩艷麗，均勻一致，核膜及核仁結(jié)構(gòu)清楚［4］，核槳對(duì)比鮮明。制片優(yōu)良率達(dá)到95%以上（圖1、2）。

圖1 改進(jìn)前的淋巴結(jié)切片（HE×200）

圖2 改進(jìn)后的淋巴結(jié)切片（HE×200）

3 討 論

淋巴結(jié)組織結(jié)構(gòu)致密，細(xì)胞豐富，間質(zhì)少，外周又有一層致密的纖維結(jié)締被膜［5］。按常規(guī)病理制片技術(shù)操作過(guò)程，如標(biāo)本取材、固定、脫水、透明和浸蠟到切片、染色等方法很難制作優(yōu)質(zhì)的淋巴結(jié)切片。應(yīng)用改進(jìn)后方法制作淋巴結(jié)HE切片，組織結(jié)構(gòu)更清晰，色彩和對(duì)比度都優(yōu)于常規(guī)切片，給病理診斷提供了可靠的保證，但是在制作淋巴結(jié)HE切片時(shí)必須注意以下環(huán)節(jié)。

3.1 避免組織損傷 組織損傷包括人為損傷、組織變干，組織損傷可由多個(gè)環(huán)節(jié)造成。人為損傷是由于病理技術(shù)人員在整個(gè)制片過(guò)程中操作不細(xì)心，造成切片劃痕等；組織變干是由于組織沒(méi)有及時(shí)固定或組織沒(méi)有完全浸泡在固定液中，致使組織發(fā)生干縮變硬。標(biāo)本及時(shí)充分地固定是制作良好組織切片的基礎(chǔ)。標(biāo)本離體后，無(wú)論大小均應(yīng)立即固定，這是切片成功的關(guān)鍵。若組織固定不良，在以后的標(biāo)本制備過(guò)程中則無(wú)法加以糾正，標(biāo)本的固定液有幾種，臨床常用10%甲醛固定液和4%中性甲醛固定液，此種固定液配制方法簡(jiǎn)單，為大多數(shù)病理科采用，但是用于短時(shí)間內(nèi)很難滲透到淋巴組織內(nèi)部，組織邊緣固定尚可，深部組織很難滲透進(jìn)去，造成組織標(biāo)本固定不均勻。采用加溫固定，可使蛋白質(zhì)凝固，但會(huì)造成組織自溶。使用改進(jìn)的B-5固定液固定淋巴結(jié)，其滲透力強(qiáng)，能迅速滲入組織內(nèi)部，能凝固組織細(xì)胞內(nèi)成分，使組織達(dá)到一定硬度，從而獲得較佳的折光率［6］。且其對(duì)染料具有較強(qiáng)的親和力，無(wú)色素沉著，染色前無(wú)需進(jìn)行脫色素處理。同時(shí)又不會(huì)使組織過(guò)度收縮或膨脹，短時(shí)間即可達(dá)到固定作用，并且能支持免疫組織化學(xué)、原位雜交和特殊染色技術(shù)［7］，是淋巴結(jié)的理想的固定液。將活檢新鮮淋巴組織標(biāo)本剖開(kāi)，立即放入改進(jìn)的B-5固定液培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。固定液的量是組織塊總體積的4～5倍［8］，固定時(shí)間3h左右，保證細(xì)胞不發(fā)生自溶和降解。

3.2 取材規(guī)范 取材要規(guī)范，淋巴結(jié)取材時(shí)，采用鋒利的刀、剪，刀刃宜薄，首先仔細(xì)剔除淋巴組織周圍的脂肪組織，切取組織刀要從刀根向后拉動(dòng)切開(kāi)組織，動(dòng)作應(yīng)輕柔不能用力擠壓組織，一刀切下避免重復(fù)，防止造成淋巴結(jié)中央凹陷或不完整，避免使用有齒鑷子。這是淋巴結(jié)取材中需特別注意的問(wèn)題，標(biāo)本大小以1.0cm×1.0cm×0.3cm為宜。若過(guò)厚固定不好，組織結(jié)構(gòu)不佳，過(guò)薄切片張數(shù)有限，如用于讀片會(huì)的切片則難以滿足需要；組織脫水，用新鮮脫水劑，室溫下進(jìn)行。加熱脫水易造成組織變硬和細(xì)胞收縮，脫水劑采用低濃度至高濃度乙醇脫水，脫水時(shí)可增加脫水梯度，以利于在高濃度乙醇和無(wú)水乙醇中將組織殘余水分除盡。脫水劑采用乙醇為佳，能置換組織中的水分，在淋巴結(jié)脫水與透明時(shí)，一般將固定好的組織塊，放入80%乙醇60min，95%乙醇Ⅰ60min，95%乙醇Ⅱ60min，無(wú)水乙醇Ⅰ30min，無(wú)水乙醇Ⅱ30min。嚴(yán)格掌握脫水時(shí)間，如脫水時(shí)間過(guò)短，影響下一步透明，脫水時(shí)間長(zhǎng)，組織收縮變硬，難以切出理想切片。組織透明及浸蠟，常規(guī)的組織透明采用二甲苯，二甲苯使用不當(dāng)很容易造成組織收縮、變脆和硬化，淋巴結(jié)組織更是如此。采用硬脂酸和石蠟的混合替代二甲苯進(jìn)行處理，作為脫水劑和石蠟間的中介劑，因硬脂酸對(duì)組織具有軟化兼透明的作用，使用硬脂酸處理標(biāo)本后，組織質(zhì)地柔韌，這樣可以有效避免組織收縮、變脆和硬化，即使纖維成分較多的組織，也容易切出薄而完整的切片。具體方法是：組織經(jīng)過(guò)無(wú)水乙醇浸畢后，用硬脂酸和石蠟的混合液替代二甲苯進(jìn)行透明劑處理。直接浸入硬脂酸和石蠟混合液Ⅰ，其配制比例為3∶2，浸入時(shí)間1h，溫度56～58℃。然后浸入硬脂酸和石蠟混合液Ⅱ，其配制比例為2∶3，浸入時(shí)間1h，溫度56～58℃，注意石蠟要定期更換。包埋的要點(diǎn)是：先將熔化的石蠟倒入包埋框，用加溫的鑷子輕輕夾住組織塊放入包埋框內(nèi)，用鑷子輕輕壓平組織塊，使組織塊平整放置，避免因鑷子用力擠壓而造成的人為破壞。包埋用蠟的熔點(diǎn)56～58℃為宜。將包埋后蠟塊稍凝固，再移入冷臺(tái)冷卻后，按報(bào)道更利于薄切［9］。

3.3 切片制作完整 切片制作要完整，切片刀要非常鋒利，最好使用一次性刀片，切片厚度2.5～3.0μm。修整蠟塊時(shí)，先粗約將蠟塊組織修平成最大面后，然后移動(dòng)刀刃用不同的區(qū)段切片。切片刀刃必須保持完好和清潔，操作時(shí)用力輕柔適當(dāng)，轉(zhuǎn)速均勻，避免切削時(shí)切片刀對(duì)蠟塊形成擠壓，導(dǎo)致組織切片比蠟塊顯著縮小，組織壓縮，細(xì)胞變形。切片刀鈍、角度太大或切片速度太快，致使切片不是被切出來(lái)的而是被刮下來(lái)的。切片動(dòng)作太猛會(huì)造成搓衣板樣改變；漂烘儀的水溫控制在40～45℃為宜，水溫太高，造成組織切片擴(kuò)散，形成人為裂隙，造成假象，容易誤診；溫度太低展片不充分，組織切片易皺褶，影響觀察。組織切片應(yīng)在水中充分伸展后裱貼，還可將切片經(jīng)30%的乙醇初展后，再用載玻片撈起放入展片箱展片更易展平?？酒瑴囟纫m當(dāng)，一般組織切片烤片多直接平放在50～55℃烤片機(jī)上10min，然后80℃電吹風(fēng)2min左右為宜。溫度高、時(shí)間長(zhǎng)，易發(fā)生組織“焦糊”現(xiàn)象。溫度低、時(shí)間短，切片太厚脫蠟不盡或染色過(guò)程中容易發(fā)生脫片；染色、封片要細(xì)心，蘇木精-伊紅染色是病理技術(shù)中最基本的方法，在病理技術(shù)中廣泛應(yīng)用，必不可少。因淋巴結(jié)細(xì)胞核比較大，細(xì)胞質(zhì)較少，與其他組織切片一起染色，容易使蘇木精深染，伊紅著色淺。淋巴結(jié)切片與其他組織切片分別進(jìn)行染色，根據(jù)蘇木精成熟程度控制染色時(shí)間，蘇木精染色時(shí)間短，一般2～3min，染色過(guò)程中0.5%～1.0%鹽酸乙醇的分化是 HE染色成敗的關(guān)鍵［10］，分化時(shí)間必須嚴(yán)格掌握，一定要恰到好處，分化不足時(shí)切片會(huì)呈現(xiàn)一片藍(lán)染，同時(shí)會(huì)影響伊紅上色，使切片層次不清，影響觀察。分化過(guò)度時(shí)，可適當(dāng)延長(zhǎng)返藍(lán)時(shí)溫水的時(shí)間，返藍(lán)不足時(shí)，不可進(jìn)行伊紅染色，否則會(huì)發(fā)生切片過(guò)于紅染，同樣影響觀察，蘇木精染色深淺和分化時(shí)間只能通過(guò)鏡下觀察來(lái)控制染色效果。

總之，淋巴結(jié)切片的制片是非常復(fù)雜細(xì)致的工作，在操作過(guò)程中每一環(huán)節(jié)都要求病理技術(shù)工作者規(guī)范操作，認(rèn)真仔細(xì)對(duì)待，而且還要在實(shí)際操作過(guò)程中不斷摸索，總結(jié)經(jīng)驗(yàn)。只有這樣才能給病理診斷提供優(yōu)質(zhì)可靠的淋巴結(jié)切片，給正確的病理診斷提供有力的技術(shù)保障。

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