唐顯軍，鐘藝華

（重慶市腫瘤研究所 400031）

心臟作為內(nèi)分泌器官存在獨(dú)立的腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS），它是心血管生理、病理最重要的調(diào)節(jié)系統(tǒng)，血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）被證實(shí)可以引起血管重構(gòu)，血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的AngⅡ可促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖與肥大［1］。在某些病理狀態(tài)下：如缺血性心臟病、組織重建、心肌梗死、血管新生內(nèi)膜損傷、血管緊張素Ⅱ2型受體（AT2R）再度重新表達(dá)。

血管重構(gòu)在原發(fā)性高血壓研究頗多，而臨床常見急性冠脈缺血事件，反復(fù)的缺血及再血管化實(shí)則已觸發(fā)了相應(yīng)冠狀動(dòng)脈構(gòu)型的變化。本實(shí)驗(yàn)采用術(shù)前相對(duì)較長(zhǎng)時(shí)間的血管緊張素Ⅱ1型受體（AT1R）阻斷，缺血再灌注術(shù)后持續(xù)阻斷AT1R來觀察大鼠冠狀動(dòng)脈重構(gòu)與AT2R表達(dá)關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型制備 健康雄性SD大鼠123只，體質(zhì)量150～250g。隨機(jī)分成3組：假手術(shù)（Sham）組11只；對(duì)照（Control）組即生理鹽水灌胃組：14只×4組（分設(shè)4個(gè)時(shí)間點(diǎn)：3、7、14、28d）；纈沙坦（ARB）組即纈沙坦10mg·kg-1·d-1灌胃組：14只×4組（分設(shè)4個(gè)時(shí)間點(diǎn)：3、7、14、28d）。各組術(shù)前4周開始灌胃。手術(shù)行氣管切開插管，連通動(dòng)物呼吸機(jī)（潮氣量約40mL／kg，呼吸頻率為每分鐘70次）。沿左側(cè)胸骨旁斜切口，手術(shù)采用開胸結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，30min后松脫結(jié)扎線，恢復(fù)血流再灌注，Sham組開胸不結(jié)扎動(dòng)脈。術(shù)后繼續(xù)給藥：前3d腹腔注射給藥，劑量各組不變，3d后改為灌胃，直至于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)（3、7、14、28d）對(duì)照組，ARB組各亞組處死取材，假手術(shù)組7d處死取材。

1.2 血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè) 各時(shí)間點(diǎn)給予2.5%戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠，逐層切開皮膚、淺筋膜、深筋膜，分離出頸總動(dòng)脈，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，近心端血管鉗鉗夾，插入聚苯乙烯心導(dǎo)管，松開血管鉗，將導(dǎo)管推送至主動(dòng)脈，連接MPA-2000M型多道生理記錄儀，當(dāng)數(shù)值穩(wěn)定時(shí)記錄動(dòng)脈收縮壓（SBP）、動(dòng)脈舒張壓（DBP）；然后將導(dǎo)管插進(jìn)左心室，當(dāng)數(shù)值穩(wěn)定時(shí)記錄左室收縮壓（LVSP）、左室舒張末壓（LVEDP），左室壓力上升、下降速率。

1.3 標(biāo)本取材 各時(shí)間點(diǎn)大鼠測(cè)定完血流動(dòng)力學(xué)后，導(dǎo)管退出左心室，從導(dǎo)管內(nèi)注射30mmol／L氯化鉀后拔除導(dǎo)管，活體灌注生理鹽水，再灌注4%多聚甲醛以預(yù)固定心臟；取出心臟標(biāo)本再行固定24h（4℃4%多聚甲醛）；常規(guī)石蠟包埋；自心臟中部開始分別向上、向下沿左室長(zhǎng)軸垂直每隔1mm橫斷面連續(xù)切片，兩張為一對(duì)（4μm厚），分別標(biāo)記＋1對(duì)、＋2對(duì)……；-1對(duì)、-2對(duì)……。免疫組化（immunohistochemistry，IHC）檢測(cè)AT2R等均用配對(duì)切片。

1.4 主要試劑 兔抗鼠Ⅰ型膠原抗體、兔抗鼠Ⅲ型膠原抗體（SantaCruz公司）；天狼猩紅（Sigma，美國(guó)）；即用型SABC、DAB顯色試劑盒、兔抗鼠AT2抗體（武漢博士德生物有限公司）。

1.5 病理檢查 血管周圍膠原容積分?jǐn)?shù)測(cè)定：每張經(jīng)PSR染色的切片，在光鏡下分為外徑為100μm以上（大冠狀動(dòng)脈）和100μm以下（小冠狀動(dòng)脈）的血管［2］，用Image Pro Plus 4.0專業(yè)顯微圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析，計(jì)算每個(gè)視野中膠原組織所占面積與血管內(nèi)腔面積之比值（劃輪廓線計(jì)算面積）。并計(jì)算中膜面積與內(nèi)膜面積之比值以及F值。F＝1視為正圓，0.75≤F＜1視為橢圓，F(xiàn)＜0.75的血管視為不規(guī)則棄之。血管緊張素受體光密度值測(cè)量：隨機(jī)取4個(gè)視野，用Image Pro Plus 4.0專業(yè)顯微圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析，通過灰度調(diào)節(jié)測(cè)量每個(gè)視野的光密度值。

2 結(jié) 果

2.1 AT2R的定位 AT2R定位于冠狀動(dòng)脈外膜呈放射狀分布。冠脈內(nèi)膜也有部分表達(dá)，見圖1。

圖1 血管緊張素受體分布

2.2 血流動(dòng)力學(xué)改變 缺血再灌注損傷（I-R）術(shù)后3d心功能明顯下降，舒張功能受損尤為明顯；28d心功能有明顯恢復(fù)，ARB組各血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)恢復(fù)接近正常水平（表1）。

2.3 I-R損傷后AT2R的動(dòng)態(tài)變化 AT2R在對(duì)照組I-R術(shù)后3d較低表達(dá)，7d時(shí)達(dá)峰值。ARB組I-R術(shù)后3、7d時(shí)AT2R高表達(dá)，且它的這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)光密度值相接近。AT2R在Sham組未檢出。I-R術(shù)后14d及28d時(shí)對(duì)照組、ARB組AT2R低檢出（圖2）。

2.4 冠狀動(dòng)脈重構(gòu) I-R術(shù)后冠狀動(dòng)脈重構(gòu)表現(xiàn)為血管周圍膠原沉積；血管中膜增生，血管腔狹窄。I-R術(shù)后28d時(shí)大冠狀動(dòng)脈血管周圍膠原容積分?jǐn)?shù)對(duì)照組高于假手術(shù)組和ARB組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而ARB組略高于Sham組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。阻力小動(dòng)脈血管周圍膠原容積分?jǐn)?shù)各實(shí)驗(yàn)組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。I-R術(shù)后血管 M／L：在阻力小動(dòng)脈、大冠狀動(dòng)脈中對(duì)照組及ARB組較Sham組高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2、圖3）。

圖2 冠狀動(dòng)脈血管周圍AT2R的變化

表1 各實(shí)驗(yàn)組I-R術(shù)后3、28d血流動(dòng)力學(xué)變化（±s）

表1 各實(shí)驗(yàn)組I-R術(shù)后3、28d血流動(dòng)力學(xué)變化（±s）

＊：P＜0.05，與Sham組比較。

組別 SBP（mm Hg） DBP（mm Hg） LVSP（mm Hg） LVEDP（mm Hg） ＋dp／dt（mm Hg／s）-dp／dt（mm Hg／s）Sham 124.9±9.3 94.8±6.2 129.7±10.1 4.8±1.2 5085±294 3 559±206 Control 3d 91.6±7.0 75.3±6.0 96.3±5.0 12.4±2.2 4 429±309 2 866±249 Control 28d 99.6±3.8 82.5±5.7 103.0±6.2 7.8±1.5 4 467±316 2 875±207 ARB 3d 93.0±9.1 73.2±6.3 89.0±10.4 10.6±3.5＊ 4 590±377 2 881±353 ARB 28d 124.2±8.2 93.8±7.1 124.9±6.6 5.3±1.35 215±409 3 464±217

表2 I-R術(shù)后28d冠狀動(dòng)脈重構(gòu)（±s）

表2 I-R術(shù)后28d冠狀動(dòng)脈重構(gòu)（±s）

＊：P＜0.05，與Sham 組比較；▲：P＜0.05，與Control組比較。

組別 小冠狀動(dòng)脈PCVF大冠狀動(dòng)脈PCVF小冠狀動(dòng)脈M／L大冠狀動(dòng)脈M／L Sham 0.33±0.04 0.53±0.08 0.59±0.08 0.40±0.05 Control 0.39±0.06 0.81±0.08＊ 0.66±0.09 0.45±0.05 ARB 0.37±0.05 0.61±0.07▲0.62±0.06 0.42±0.05

圖3 膠原沉積

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：AT2R定位于冠狀動(dòng)脈外膜呈放射狀分布，尤以大血管冠周密度較高，冠狀動(dòng)脈內(nèi)膜也有部分表達(dá)。Akishita等［3］認(rèn)為 AT2R定位于冠狀動(dòng)脈管周區(qū)，成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)AT2R，與本實(shí)驗(yàn)觀察較一致。

血管重構(gòu)一直以來受到學(xué)術(shù)界廣泛的關(guān)注，有學(xué)者用中膜／內(nèi)腔比值來觀察［4］。管腔狹窄、中膜平滑肌增生導(dǎo)致的中膜增厚、血管周圍膠原的沉積無一不影響著血管的生物學(xué)活性，而不同口徑的冠狀動(dòng)脈發(fā)生重構(gòu)及其產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)是不完全一致的。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道：大動(dòng)脈重構(gòu)主要表現(xiàn)主動(dòng)脈中層VSMC增加，而小動(dòng)脈主要通過持續(xù)收縮狀態(tài)增加微循環(huán)阻力，而其VSMC增殖和細(xì)動(dòng)脈管壁纖維化的器質(zhì)性病變不明顯［5］。

本實(shí)驗(yàn)因客觀條件的限制粗略地將冠狀動(dòng)脈按內(nèi)徑大小以100μm為界值分成兩組：大冠狀動(dòng)脈（內(nèi)徑遠(yuǎn)大于100μm）和小冠狀動(dòng)脈（內(nèi)徑小于100μm）。為減少可能產(chǎn)生的誤差，在圖像分析處理時(shí)，盡量采集規(guī)則圓形或近圓形分析。對(duì)照組冠狀血管周圍膠原沉積，I-R術(shù)后28d大冠狀動(dòng)脈血管周圍膠原容積分?jǐn)?shù)對(duì)照組高于假手術(shù)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而冠狀動(dòng)脈中膜面積與內(nèi)腔面積的比值雖然與Sham組無顯著性差異，但大冠狀動(dòng)脈及阻力小動(dòng)脈M／L高于Sham組，且阻力小動(dòng)脈M／L增加的幅度相對(duì)高于主冠狀動(dòng)脈，這些結(jié)果提示：在I-R的冠狀動(dòng)脈重構(gòu)中，大冠狀動(dòng)脈的血管周圍膠原沉積可能占相對(duì)優(yōu)勢(shì)，而阻力小血管中膜增厚可能會(huì)在此后更長(zhǎng)時(shí)間的小冠狀動(dòng)脈重構(gòu)中會(huì)占相對(duì)優(yōu)勢(shì)。冠狀動(dòng)脈的這種形態(tài)結(jié)構(gòu)的幾何改變與小冠狀動(dòng)脈阻力增加，大動(dòng)脈的彈性、順應(yīng)性下降等生物學(xué)行為變化是相關(guān)聯(lián)的。冠狀動(dòng)脈構(gòu)型的這種改變最終將傳導(dǎo)至心臟血流動(dòng)力學(xué)的改變，以致本實(shí)驗(yàn)觀察到IR術(shù)后3d心功能明顯下降，尤以舒張功能受損明顯。

在ARB組作者觀察到膠原在血管周圍的沉積受到抑制，在大冠狀動(dòng)脈管周PCVF與對(duì)照組比較明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，28d時(shí)的PCVF較接近于Sham組。同時(shí)，IHC染色發(fā)現(xiàn)AT2R在血管周圍有一過性的高表達(dá)，血管內(nèi)皮細(xì)胞也有少量表達(dá)，在本實(shí)驗(yàn)中AT2R在血管重構(gòu)方面的這種變化是與文獻(xiàn)報(bào)道相一致的。不同級(jí)別的動(dòng)脈血管發(fā)生重構(gòu)的形態(tài)學(xué)變化不同，其機(jī)制也不一致［6-7］。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶受體拮抗劑（ARB）可通過阻斷AngⅡ的介導(dǎo)反應(yīng)，從而抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)，影響血管重構(gòu)，延緩動(dòng)脈硬化及心血管病的進(jìn)展［8］。RAS系統(tǒng)、血管重構(gòu)之間存在著復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系，AngⅡ在其中起關(guān)鍵調(diào)控作用［9］。AngⅡ還可能通過結(jié)締組織生長(zhǎng)因子、炎癥因子的表達(dá)刺激膠原纖維增生以及細(xì)胞外基質(zhì)沉積、加速血管平滑肌的生長(zhǎng)發(fā)育，促進(jìn)血管重構(gòu)的形成［10］。

因此作者推測(cè)I-R損傷術(shù)后冠狀動(dòng)脈血管發(fā)生重構(gòu)：主要表現(xiàn)為大冠狀動(dòng)脈血管周圍的膠原沉積，小冠狀動(dòng)脈M／L增加。AT2R在抑制膠原沉積，改變動(dòng)脈中膜內(nèi)腔比值中起重要作用，纈沙坦可能正是通過心肌I-R損傷后AT2R的一過性高表達(dá)來抑制冠狀動(dòng)脈重構(gòu)而達(dá)到保護(hù)心功能的目的。

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