吳汪澤，熊 濤，甘 甜，盧忠心，喬 治△

（1.湖北省武漢市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科 430014；2.武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物教研室，武漢430071；3.信陽(yáng)師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，河南信陽(yáng)464000）

一氧化氮（nitric oxide，NO）是生物機(jī)體中一種重要的生物信息分子和效應(yīng)分子［1］。它在舒張血管平滑肌、傳遞神經(jīng)間信息、抑制血小板聚集、介導(dǎo)炎癥和免疫反應(yīng)等生理和病理過程均發(fā)揮著重要的作用［2］。因此其準(zhǔn)確檢測(cè)對(duì)NO作用機(jī)制的研究具有重要的意義。電化學(xué)方法是目前惟一能夠?qū)ι矬w內(nèi)NO釋放過程進(jìn)行直接、實(shí)時(shí)、連續(xù)檢測(cè)的方法［3］。本實(shí)驗(yàn)采用原位化學(xué)種子-生長(zhǎng)技術(shù)，制備了一種基于納米金柱電極的NO電化學(xué)微傳感器，并通過修飾高分子材料Teflon膜，極大地提高了傳感器的選擇性和穩(wěn)定性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 MonoStat電化學(xué)工作站（美國(guó)DTI公司），AB204-E分析天平（瑞士 Mettler Toledo公司），QB-206旋轉(zhuǎn)搖床（海門其林貝爾儀器制造有限公司），DHG-9023A干燥箱（上海精宏儀器有限公司）。直徑為150μm的玻璃纖維（美國(guó)WPI公司），Teflon AF2400（美國(guó)DuPont公司），氯金酸、鹽酸羥胺、硼氫化鉀和檸檬酸鈉均購(gòu)于中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，實(shí)驗(yàn)用水為雙蒸水。

1.2 方法

1.2.1 NO標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 如文獻(xiàn)［4］所述。

1.2.2 納米金溶液的制備 將1mL 1%氯金酸溶于90mL雙蒸水中，攪拌1min后加入2mL 38.8mmol／L檸檬酸鈉溶液，攪拌1min。再加入1mL現(xiàn)配的0.075%硼氫化鉀溶液，攪拌5min，4℃避光保存［5］。

1.2.3 納米金柱的制備 將長(zhǎng)度為1.5cm的玻璃纖維依次置于10mmol／L十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）溶液30℃浸泡1h、納米金溶液中4℃過夜；然后置于1.5mL雙蒸水中，加入20mL 0.2mol／L 氯金酸和10μL 0.2mol／L鹽酸羥胺，于搖床上旋轉(zhuǎn)30min后洗滌；重復(fù)以上操作4次后自然晾干，玻璃纖維表面呈金黃色，即制得納米金柱。

1.2.4 修飾電極的制備 用銀導(dǎo)電膠將細(xì)銅絲粘連到納米金柱的一端，然后用10μL移液器槍頭對(duì)其加以固定，并用環(huán)氧樹脂膠將兩端粘結(jié)封閉。將露出的納米金柱剪至長(zhǎng)度為5 mm，即制得納米金修飾玻璃纖維電極。將電極在1%Teflon溶液中浸泡10s后，100℃烘烤2h，即制得NO微傳感器。

1.2.5 檢測(cè)方法 采用三電極系統(tǒng)：Ag／AgCl為參比電極，鉑絲為對(duì)電極和所制備的電極為工作電極。0.01mol／L磷酸鹽緩沖液（PBS）（pH 7.2）作為底液，利用安培響應(yīng)法對(duì)NO進(jìn)行測(cè)定，考察該NO微傳感器對(duì)NO的電化學(xué)響應(yīng)及其靈敏度、線性范圍、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性等。

2 結(jié) 果

2.1 納米金柱微電極上NO的電化學(xué)響應(yīng) 加入360nmol／L的NO標(biāo)準(zhǔn)溶液，納米金柱微電極上的氧化峰電流很大（圖1曲線a），Teflon修飾后電極上的氧化峰電流減?。▓D1曲線b）；Teflon修飾后電極的背景噪聲明顯減小，且背景基線顯著降低。由于納米金柱具有較大的有效表面積，為NO的電化學(xué)氧化提供更多的活性位點(diǎn)，因此納米金柱對(duì)NO的氧化有優(yōu)異的電催化作用，見圖1。

圖1 不同修飾電極上NO的安培響應(yīng)

2.2 NO微傳感器的性能分析 在10mL半密閉電解池中以5mL PBS作為底液，插入電極，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，加入一定體積的NO標(biāo)準(zhǔn)溶液到底液中，利用安培響應(yīng)法對(duì)NO進(jìn)行測(cè)定。隨著NO標(biāo)準(zhǔn)溶液的連續(xù)加入，其氧化峰電流迅速增加并很快達(dá)到穩(wěn)態(tài)，并與加入NO標(biāo)準(zhǔn)溶液的量呈正相關(guān)。在7.2 nmol／L至 11.7μmol／L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（r＝0.998），線性方程是I／nA＝15.028＋0.036CNO，檢出限是3.6nmol／L（S／N＝3）。同一支 NO微傳感器連續(xù)5次相同檢測(cè)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）為2.4%，將同批制備的5支NO微傳感器在相同條件下檢測(cè)，RSD為4.6%，表明該傳感器具有良好的重現(xiàn)性。將傳感器在室溫下放置7d，其響應(yīng)電流是放置前的95%，提示其穩(wěn)定性優(yōu)異。干擾試驗(yàn)的結(jié)果顯示：2 μmol／L的 NO2-、多巴胺（DA）、抗壞血酸（AA）和 NH4＋，或20μmol／L的NO3-、尿酸（UA）、葡萄糖等物質(zhì)對(duì)NO的檢測(cè)不產(chǎn)生干擾（信號(hào)變化小于5%）。因此，該傳感器具有良好的選擇性，可用于檢測(cè)生物樣品中NO含量。

3 討 論

硝酸甘油作為治療突發(fā)性心絞痛的特效藥已沿用了100多年，其藥理作用是硝酸甘油在生理?xiàng)l件下釋放出的NO可以舒張心血管平滑肌，近年逐漸發(fā)現(xiàn)NO在生物體內(nèi)發(fā)揮著更多重要的作用。NO作為一種重要的生物信使分子，參與血管調(diào)節(jié)、神經(jīng)傳遞、炎癥與免疫等過程，其廣泛分布在腦、血管、肺、生殖器等多種組織器官中，且與高血壓、心肌缺血、動(dòng)脈硬化和哮喘等系統(tǒng)性疾病有關(guān)［6-8］。對(duì)NO的認(rèn)識(shí)首先要?dú)w功于微量分析技術(shù)的發(fā)展，因?yàn)镹O在機(jī)體內(nèi)的濃度通常處于納摩爾級(jí)水平，且NO半衰期為5s，因而直接檢測(cè)難度極大［9］。因此，準(zhǔn)確地分析NO在生物機(jī)體中的濃度變化，已成為進(jìn)一步揭示NO功能的必要手段。

建立準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快速、靈敏的NO檢測(cè)方法成為醫(yī)學(xué)界普遍關(guān)心的問題，重氮反應(yīng)法是目前應(yīng)用最為廣泛的方法之一，其原理是通過檢測(cè)NO的代謝終產(chǎn)物NO2-和NO3-來間接推算出NO的濃度。但機(jī)體中NO2-和NO3-不完全來源于NO代謝，這就造成該方法存在較大誤差［10］。電化學(xué)方法能夠直接、實(shí)時(shí)、連續(xù)檢測(cè)生物體內(nèi)釋放的NO，其特點(diǎn)是靈敏度高、響應(yīng)快、操作簡(jiǎn)單、選擇性好、儀器設(shè)備成本低［11］。安培響應(yīng)法是在工作電極和參比電極間施加一個(gè)固定電位，通過檢測(cè)NO氧化時(shí)所產(chǎn)生的微小的氧化峰電流，氧化峰電流與NO的濃度呈成正相關(guān)。其具有靈敏度高和響應(yīng)時(shí)間快等優(yōu)點(diǎn)，可用于檢測(cè)生物體內(nèi)NO濃度隨時(shí)間變化的情況［12］。

納米金具有良好的生物兼容性和優(yōu)異的電催化性能［13］，本研究選擇直徑為150μm的柱狀玻璃纖維為基底材料，采用原位化學(xué)種子-生長(zhǎng)技術(shù)，制備了一種基于納米金柱的NO電化學(xué)微傳感器。采用快速化學(xué)還原法制備納米金晶核，并將晶核作為種子吸附在玻璃纖維表面；然后在穩(wěn)定的生長(zhǎng)溶液中將氯金酸還原為金單質(zhì)，隨著金單質(zhì)在納米金晶核上不斷析出，納米金顆粒逐漸變大，從而實(shí)現(xiàn)納米金顆粒的可控生長(zhǎng)。Teflon是目前已知所有聚合物中透氣性最高的高分子化合物［14］，允許NO以與樣品中的NO濃度成比例的速度通過Teflon膜達(dá)到電極表面并被氧化，大大加快了傳感器的響應(yīng)時(shí)間。Teflon膜還可以防止蛋白質(zhì)等一些生物分子在電極表面的非特異性吸附而引起的電極表面鈍化，從而提高電極的穩(wěn)定性和電極的使用壽命。本研究還考察了體內(nèi)存在的一些電活性強(qiáng)的物質(zhì)對(duì)微傳感器檢測(cè)的影響，發(fā)現(xiàn)微傳感器不受高濃度的亞硝酸鹽、硝酸鹽、多巴胺、抗壞血酸、銨鹽和L-精氨酸等生物小分子的干擾，信號(hào)變化均小于5%，且干擾實(shí)驗(yàn)前后加入同濃度的NO標(biāo)準(zhǔn)溶液，其安培響應(yīng)無顯著差別。因此，本方法制備的微傳感器表現(xiàn)出靈敏度高、線性范圍寬、重現(xiàn)性好和抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。

綜上所述，NO電化學(xué)微傳感器的使用為NO的實(shí)時(shí)檢測(cè)和生物樣品的檢測(cè)提供了一種實(shí)用、簡(jiǎn)便的方法，不僅能夠從本質(zhì)上揭示某些生理現(xiàn)象，也為探索相關(guān)疾病的監(jiān)控和病理研究提供了技術(shù)保障。

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