肖 飛，邱 健，鐘國強(qiáng)△，曾志羽，涂榮會(huì)，何 燕，李 爍

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管病研究所，南寧530021；2.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院心血管內(nèi)科 510010）

原發(fā)性高血壓（essential hypertension，EH）作為一種病因未明的多基因多因素疾病，是個(gè)體的遺傳易感性和環(huán)境致病因子共同作用的結(jié)果。國內(nèi)外研究已發(fā)現(xiàn)數(shù)十種基因與EH相關(guān)。細(xì)胞色素 P450（cytochrome P450，CYP）超家族包括CYP1～4 4個(gè)家族和A、B、C、D、E亞家族及數(shù)十種同工酶，參與各種內(nèi)、外源性物質(zhì)的代謝，對(duì)某些疾病的發(fā)生發(fā)展也有重要影響。其中CYP3A酶類參與皮質(zhì)醇和皮質(zhì)酮的新陳代謝，使其轉(zhuǎn)化為6β-羥基皮質(zhì)醇和6β-羥基皮質(zhì)酮，其活性與血壓相關(guān)［1］。CP3A5是CYP3A家族中重要的亞家族，是人類腎組織中主要的CYP3A表達(dá)酶，腎臟內(nèi)CYP3A介導(dǎo)的酶活性依賴于CYP3A5基因型［2］，且其與腎臟近端小管鈉的重吸收有關(guān)［3］。因此其本身所具有的遺傳多態(tài)現(xiàn)象導(dǎo)致CYP3A酶類活性不同及CYP3A5表達(dá)差異，進(jìn)而影響內(nèi)源性皮質(zhì)醇的新陳代謝作用，可能最終通過影響鈉的重吸收而影響血壓。本研究旨在檢測(cè)EH患者和對(duì)照者的CYP3A5＊3（6986A＞G）位點(diǎn)多態(tài)性，分析其與中國漢族人EH之間的關(guān)系，及對(duì)血壓的影響，尋找與EH有關(guān)的可能遺傳標(biāo)記。

1 資料與方法

1.1 一般資料 所有研究對(duì)象均從2011年10月至2012年6月本院老年心血管內(nèi)科住院患者及健康體檢人群中選取。（1）EH組：參照1999年WHO／ISH高血壓指南的診斷標(biāo)準(zhǔn)，收縮壓（SBP）≥140mm Hg和（或）舒張壓（DBP）≥90mm Hg；或者既往有高血壓病史，正在服用降壓藥物；其中男119例，女51例，年齡（63.05±10.54）歲。（2）對(duì)照組：符合SBP＜140 mm Hg、DBP＜90mm Hg，排除既往高血壓史，其中男109例，女84例，年齡（58.18±12.62）歲。流行病學(xué)調(diào)查內(nèi)容包括：吸煙史、血壓以及臨床一般生化指標(biāo)的測(cè)定。所有研究對(duì)象均為自然人群，漢族且無血緣關(guān)系，均排除繼發(fā)性高血壓，排除肝、腎、腫瘤、糖尿病等其他嚴(yán)重的全身性疾病。

1.2 方法

1.2.1 人的基因組DNA提取 于清晨采集EH患者和對(duì)照者外周靜脈血5mL，置于乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-K2）抗凝管中保存于-70℃超低溫冰箱中以備提取DNA。將儲(chǔ)存抗凝血按人血液DNA提取試劑盒操作步驟提取白細(xì)胞基因組DNA，DNA提取試劑盒為Tiangen公司人血／細(xì)胞／組織DNA提取試劑盒，所提取的DNA于-20℃保存。

1.2.2 引物和Taqman MGB探針設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank收錄的CYP3A5基因家族，查找CYP3A5＊3等位基因序列，通過BLAST對(duì)比，針對(duì)CYP3A5＊3等位基因保守序列設(shè)計(jì)引物和TaqMan MGB探針。引物F為：AAT GCT CTA CTG TCA TTT CTA ACC ATA ATC，引物R為：TCA CAC AGG AGC CAC CCA A，探針1（G）為：FTG TCT TTC AGT ATC TCT TP，探針2（A）為：6TGT CTT TCA ATA TCT CTT CP（F代表FAM，6代表HEX，P代表MGB基團(tuán)）。以上均由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司合成。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè) 對(duì)CYP3A5基因目的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增及SNP分型。RT-PCR反應(yīng)體系（25μL）最終成分為：模板DNA 1μL、Master MiX酶12.5μL，引物各1μL，探針各0.5μL，滅菌雙蒸水8.5μL。在Rotor-Gene 6000RT-PCR儀上反應(yīng)：95℃預(yù)變性5min，然后95℃變性30s，60℃退火延伸1min，儀器同時(shí)收集熒光信號(hào)，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。軟件分析得出SNP分型結(jié)果。

1.2.4 測(cè)序驗(yàn)證SNP分型結(jié)果 將DNA模板抽樣共10例，經(jīng)PCR法對(duì)CYP3A5基因目的片段進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列參考文獻(xiàn)［4］設(shè)計(jì)，上游引物為：5′-CAT GAC TTA GTA GAC AGA TGA C-3′，下游引物為：5′-GGT CCA AAC AGG GAA GAA ATA-3′，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。10×PCR buffer、rTaqDNA聚合酶、dNTP等試劑由TaKaRa公司生產(chǎn)。擴(kuò)增產(chǎn)物為293bp片段，建立50μL反應(yīng)體系：10×PCR buffer 5μL，Takara Tap 0.25μL，2.5mmol／L dNTP 4 μL，10.0μmol／L的上下游引物各4μL，模板DNA 4μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)至50μL；擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性7min，然后94℃變性1min，55℃復(fù)性1min，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物送至上海英駿生物技術(shù)有限公司直接測(cè)序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，t檢驗(yàn)，χ2檢驗(yàn)用于計(jì)數(shù)資料的關(guān)聯(lián)分析和Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，應(yīng)用logistic回歸分析法進(jìn)行多因素回歸分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般臨床特征比較 兩組間尿素氮、血糖、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。EH組年齡、SBP、DBP、三酰甘油（TG）水平明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表1。

表1 高血壓組與對(duì)照組臨床資料比較（±s）

表1 高血壓組與對(duì)照組臨床資料比較（±s）

a：P＜0.05，b：P＜0.01，與對(duì)照組比較。

項(xiàng)目 高血壓組（n＝170） 對(duì)照組（n＝190）58.18±12.62 SBP（mm Hg） 143.83±16.38b 120.70±11.14 DBP（mm Hg） 80.64±11.29b 72.47±9.26尿素氮（mmol／L） 5.67±2.75 5.38±1.62血糖（mmol／L） 5.37±0.92 5.16±0.96 TC（mmol／L） 4.68±0.99 4.68±0.80 LDL-C（mmol／L） 3.01±0.86 2.92±0.65 HDL-C（mmol／L） 1.06±0.28b 1.20±0.34 TG（mmol／L） 1.78±0.93a年齡（歲） 63.05±10.54b 1.55±0.83

2.2 CYP3A5基因擴(kuò)增目的片段的Taqman MGB PCR體系分型結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)Taqman MGB探針1的5′端標(biāo)記FAM，通過綠色通道檢測(cè)G堿基，探針2的5′端標(biāo)記HEX通過黃色通道檢測(cè)A堿基，3′端標(biāo)記不發(fā)光的粹滅基團(tuán)并連接 MGB基團(tuán)。當(dāng)黃色通道未檢測(cè)到熒光信號(hào)，綠色通道檢測(cè)到熒光信號(hào)，表現(xiàn)為GG純合型；當(dāng)綠色及黃色通道均檢測(cè)到熒光信號(hào)，表現(xiàn)為GA雜合型；當(dāng)綠色通道未檢測(cè)到熒光信號(hào)，黃色通道檢測(cè)到熒光信號(hào)時(shí)，表現(xiàn)為AA野生型；運(yùn)用Taqman MGB探針法，所有研究對(duì)象的CYP3A5基因擴(kuò)增目的片段均得到滿意SNP分型結(jié)果，獲得3種基因型：GG純合突變型（CYP3A5＊3／＊3）、GA 雜合突變型（CYP3A5＊1／＊3）、AA 野生型（CYP3A5＊1／＊1）。

2.3 CYP3A5基因擴(kuò)增目的片段的測(cè)序結(jié)果 抽樣測(cè)序的10例DNA模板PCR產(chǎn)物均得到滿意擴(kuò)增。10例樣本測(cè)序結(jié)果與Taqman MGB分型結(jié)果一致。檢測(cè)到2種基因型：GG純合突變型（CYP3A5＊3／＊3）、GA 雜合突變型（CYP3A5＊1／＊3），未檢測(cè)到 AA野生型（CYP3A5＊1／＊1）。

2.4 CYP3A5＊3（6986A＞G）多態(tài)性位點(diǎn)基因型分布頻率及等位基因頻率分布 兩組CYP3A5＊3（6986A＞G）基因型和等位基因分布均符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）。EH組 GG、GA、AA基因型頻率分別為51.2%、42.4%、6.5%，而對(duì)照組則為39.9%、50.8%、9.3%；EH 組 GA＋AA基因型頻率低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝4.643，P＝0.031），通過相對(duì)危險(xiǎn)度分析發(fā)現(xiàn)，GG基因型者EH的患病風(fēng)險(xiǎn)是GA＋AA基因型者的1.579倍，見表2。等位基因頻率分布在兩組間相比也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，EH組A等位基因頻率分布低于對(duì)照組（χ2＝4.192，P＝0.041），見表3。

表2 CYP3A5＊3基因型分布頻率

表3 CYP3A5＊3等位基因分布頻率

2.5 EH危險(xiǎn)因素的非條件Logistic回歸分析 以有無高血壓為因變量，將性別、年齡、吸煙、TC、LDL-C、HDL-C、TG、基因型引入Logistic回歸模型。結(jié)果顯示，基因型（GG）是EH的一項(xiàng)獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見表4。

2.6 CYP3A5＊3各基因型間血壓水平的比較 以基因型分組，比較分析發(fā)現(xiàn)EH組GG基因型者SBP（143.60±17.12）mm Hg和DBP（79.54±11.12）mm Hg與GA＋AA基因型者SBP（144.06±15.75）mm Hg和 DBP（81.72±11.43）mm Hg相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；對(duì)照組GG基因型者SBP（122.82±11.82）mm Hg和DBP（73.12±9.70）mm Hg與GA＋AA 基 因 型 者 SBP（119.37±10.54）mm Hg 和 DBP（72.07±9.00）mm Hg比較，差 異 也 無 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義 （P＞0.05），但可以發(fā)現(xiàn)GA＋AA基因型者存在稍低的SBP水平。

表4 高血壓危險(xiǎn)因素的Logistic回歸分析

3 討 論

CYP3A5是CYP3A亞家族中主要的酶系，它的表達(dá)及活性有著很大的個(gè)體和種族差異，這種差異與其單核苷酸多態(tài)性有關(guān)，是造成CYP3A代謝的外源性及內(nèi)源性物質(zhì)差異的最重要因素。目前在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的30多種CYP3A5突變型中，位于第3號(hào)內(nèi)含子的6986A＞G突變最具功能意義，它導(dǎo)致mRNA的剪接發(fā)生改變以及蛋白質(zhì)截短，使得應(yīng)至少攜帶一個(gè)CYP3A5＊1（A）等位基因，才能在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄完整的CYP3A5mRNA及表達(dá)，而攜帶基因?yàn)镃YP3A5＊3／＊3（GG）的不表達(dá)CYP3A5［5］。CYP3A5＊3的基因頻率存在明顯的種族差異，在白種人中的分布頻率為70%～85%，在黑人中為27%～50%，在亞洲人中為65%～85%［6］，在中國漢族人中為72.7%［7］。

研究提示CYP3A5基因多態(tài)性與EH的發(fā)病具有相關(guān)性，但研究結(jié)論不一。最初在高血壓大鼠模型實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，CYP3A活性的增加能增強(qiáng)6β-羥基類固醇的生成，導(dǎo)致高血壓［8］。在人類所進(jìn)行的相關(guān)研究中，Givens等［2］首先發(fā)現(xiàn)了CYP3A5＊1等位基因型個(gè)體與CYP3A5＊3等位基因型個(gè)體比較擁有較高的SBP、平均動(dòng)脈壓和內(nèi)生肌酐清除率。隨后Herbert等［9］在黑種人的研究中，發(fā)現(xiàn)CYP3A5＊1等位基因可能與EH的發(fā)病具有相關(guān)性。在關(guān)于白種老年人的研究中，發(fā)現(xiàn)CYP3A5＊1／＊3表達(dá)子顯著高的出現(xiàn)在高血壓組［10］。而Lieb等［11］及 Langaee等［12］的研究發(fā)現(xiàn)，CYP3A5＊1等位基因?qū)ρ獕簾o明顯影響，與高血壓發(fā)病不具有相關(guān)性。Reinhold等［13］的研究結(jié)果提示攜帶CYP3A5＊1等位基因者存在較低的SBP及脈壓水平。Fromm等［14］在青年白種人的研究中發(fā)現(xiàn)，CYP3A5＊3／＊3基因型者比＊1／＊3者擁有顯著升高的24h動(dòng)態(tài)收縮壓值。最近Zhang等［15］在對(duì)238例日本男性的研究中發(fā)現(xiàn)，CYP3A5＊3／＊3基因型者的SBP和DBP與其鹽的攝入水平顯著相關(guān)。Xi等［16］經(jīng) Meta分析得出，在白種人中CYP3A5＊1等位基因攜帶者擁有低的SBP。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)170例EH患者和193例對(duì)照者CYP3A5＊3基因多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)高血壓組GA＋AA基因型分布頻率低于對(duì)照組，GG基因型者EH的患病風(fēng)險(xiǎn)是GA＋AA基因型者的1.579倍，同時(shí)高血壓組A等位基因頻率分布也低于對(duì)照組。提示A（CYP3A5＊1）等位基因可能降低EH的患病風(fēng)險(xiǎn)，與Reinhold等［13］的研究結(jié)論基本相符。與在高血壓大鼠模型試驗(yàn)［8］中得出的結(jié)論不一，考慮可能人類腎臟CYP3A5同工酶的表達(dá)模式與大鼠不同［17］，同時(shí)，要比較人類與大鼠腎臟內(nèi)所有的CYP3A酶類的活性與功能比較困難。也與Givens等［2］的研究結(jié)論不符，可能與人種、性別、年齡等混雜因素，以及高血壓在不同種族或民族中發(fā)病機(jī)制的不同，基因型及等位基因頻率的分布狀況，以及基因多態(tài)性對(duì)該基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的影響在不同種族間的差異、血壓水平的被動(dòng)性、環(huán)境和遺傳因素的相互作用等多種影響因素有關(guān)。另外對(duì)照組GA＋AA基因型者存在稍低的SBP水平，與 Reinhold等［13］、Xi等［16］研究結(jié)論類似。此外本研究中對(duì)照組CYP3A5＊3等位基因頻率為65.3%，低于Li等［7］報(bào)道的中國人CYP3A5＊3等位基因頻率72.2%，可能是本研究中對(duì)照組研究對(duì)象均為年齡較大的非EH患者，也可以從側(cè)面說明CYP3A5＊1（A）等位基因可能對(duì)原發(fā)性高血壓具有保護(hù)作用。

原發(fā)性高血壓的發(fā)生受遺傳、環(huán)境等多因素的相互影響，而基因多態(tài)性存在種族、民族及地域間的差異，CYP3A5＊3基因多態(tài)性與原發(fā)性高血壓之間是否真正存在相關(guān)性，是通過影響SBP還是DBP的水平而影響原發(fā)性高血壓的發(fā)病，是否與鹽的攝入水平相關(guān)等等，目前尚無定論。本研究結(jié)果僅僅是一個(gè)提示，但也不能完全排除由于樣本數(shù)量和選擇偏倚而產(chǎn)生的差異，因此今后的研究需要進(jìn)一步進(jìn)行大樣本研究，以及研究EH縱多影響因素之間的相互作用。

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