申 東，李 莉，高 建

（重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院消化內科 400010）

原發(fā)性肝癌（primary hepatic cancer，PHC）是最常見的惡性腫瘤之一，其惡性程度高，往往發(fā)現(xiàn)的時候已屬晚期，治療效果差，故早期診斷對于肝癌患者的預后至關重要。甲胎蛋白（AFP）目前是應用最廣的肝癌標志物，在肝癌的診斷、治療及療效監(jiān)測中具有重要的作用。但是在活動性肝病、妊娠、生殖腺胚胎源性腫瘤和少數腎、胰、結腸、直腸癌也可有AFP的增高，顯示AFP診斷肝癌的局限性。由于肝細胞癌具有較高的異質性，同時檢測兩種或以上的腫瘤生物標志物被認為是腫瘤早期診斷的較好選擇［1-2］。

熱休克蛋白-27（heat shock protein，HSP-27）是小分子熱休克蛋白亞家族中重要的一員，參與了細胞的增殖、分化以及細胞凋亡的信號轉導調節(jié)，與腫瘤關系密切，是一個涉及細胞生長、細胞凋亡、腫瘤的發(fā)生和轉移等功能的重要蛋白，在乳腺、肝、結腸、肺等多種腫瘤細胞中異常過表達，并與腫瘤的惡性程度有關［3］。磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（glypican-3，GPC-3）在肝癌組織中高表達，而在非肝癌組織及正常組織中沒有表達或表達量極低，其表達的陽性率高于AFP，有可能成為用于診斷PHC新的腫瘤標志物［4］。本實驗通過免疫組織化學方法檢測肝癌、肝硬化、肝炎、良性肝臟占位組織中的HSP-27與GPC-3的表達情況，探討這二者在肝癌診斷中的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料 32例肝癌組織、30例肝硬化組織、25例良性肝臟占位組織（14例肝囊腫、11例肝血管瘤組織）取自本院肝膽外科，31例慢性肝炎組織標本取自本院消化內科及感染科。其中肝癌組織為術前未經放療、化療的原發(fā)性肝癌患者的手術切除標本，均取無壞死癌組織和無癌細胞浸潤的癌旁組織。肝癌患者中男22例，女10例；年齡39～83歲（≤50歲12例，＞50歲20例）。血清乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）陽性18例，陰性14例：AFP≤400μg／L 18例，＞400μg／L 14例，瘤體直徑小于或等于5cm 14例，大于5cm 18例。腫瘤組織Edmondson-Steiner分級：Ⅰ級6例，Ⅱ級14例，Ⅲ級2例，Ⅳ級10例。肝癌TNM分期Ⅰ期16例，Ⅱ期2例，Ⅲ期12例，Ⅳ期2例。標本經4%甲醛固定，脫水，常規(guī)石蠟包埋。

1.2 試劑 鼠抗人HSP-27單克隆抗體、鼠抗人GPC-3單克隆抗體均購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司，ChemMateTM EnVision／HRP兔／鼠通用型二抗購自基因科技（上海有限公司），10mmol／L磷酸鹽緩沖液（PBS）、蘇木素。

1.3 方法 用病理組織切片機將組織標本石蠟塊切成3μm厚切片，再以免疫組織化學染色二步法（SP法）檢測HSP-27及GPC-3的表達。免疫組化主要步驟：石蠟切片脫蠟和水化后，高壓煮沸修復。切片加50μL過氧化酶溶液，室溫下孵育10min。PBS（pH 7.4）沖洗（3×5min下同）。切片加50μL的非免疫性動物血清，室溫下孵育10min，吸去多余的液體。切片加50μL的一抗，室溫下孵育60min或4℃過夜。PBS沖洗3×5min切片加50μL通用型二抗，室溫下孵育10min。PBS沖洗3×5min切片加100μL新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察3～10min。自來水沖洗，蘇木素復染，中性樹膠封固。

1.4 結果判定 每張切片在400倍顯微鏡下隨機取5個視野，每視野計數100個癌細胞為基數，將著色細胞所占比例的平均數作為評定依據。分為陰性（-），細胞無著色或著色細胞小于5%；弱陽性（＋），著色細胞占5%～25%；陽性（＋＋），著色細胞占26%～50%；強陽性（＋＋＋），著色細胞超過50%。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析。采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 HSP-27在肝癌、肝硬化、肝炎、良性肝臟占位組織中的表達 HSP-27主要表達在細胞質，少數可見胞膜表達，呈棕黃色。其在肝癌組織中高表達，陽性率56.25%（18／32），而在癌旁組織中未見表達；HSP-27在30例肝硬化組織中的陽性率為20%（6／30），與其在肝癌組織中的表達差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而在肝炎組織、良性肝臟占位組織中均未見表達，見圖1。

2.2 GPC-3在肝癌、肝硬化、肝炎、良性肝臟占位組織中的表達 GPC-3主要表達在胞質中，呈棕褐色。其在肝癌組織中高表達，陽性率87.5%（28／32），在癌旁組織中偶見表達（3／32）；GPC-3在肝硬化組織中的陽性率為40%（12／30），與其在肝癌組織中的表達差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；在肝炎組織、良性肝臟占位組織中均未見表達，見圖2。

2.3 HSP-27、GPC-3的表達與原發(fā)性肝癌臨床特征的關系HSP-27在肝癌組織的表達，與肝癌細胞的分化程度及臨床分期有關，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），在Ⅲ～Ⅳ級及Ⅲ～Ⅳ期的肝癌組織中的HSP-27的陽性率分別為100.0%、85.7%，明顯高于Ⅰ～Ⅱ級及Ⅰ～Ⅱ期肝癌組織的HSP-27的陽性率；但HSP-27的表達與患者年齡、性別、腫瘤大小、HB-sAg定性和AFP定量無關；GPC-3在肝癌組織的表達則與腫瘤病理分級、臨床分期、腫瘤大小、HBsAg定性和AFP定量無關，但在性別、年齡上的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

圖1 HSP-27在肝癌、肝硬化、肝炎、良性肝臟占位組織中的表達（SP染色 ×40）

表1 HSP-27、GPC-3的表達與原發(fā)性肝癌臨床特征的關系

圖2 GPC-3在肝癌、癌旁、肝硬化、肝炎、良性肝臟占位組織中的表達（SP染色 ×100）

3 討 論

HSP-27是功能很強并普遍存在的一種分子伴侶，其重要的生物學功能包括保護細胞免受各種應激因素的損傷、參與細胞增殖分化，在細胞凋亡的多個關鍵點起作用，在癌細胞中表達水平很高，并參與癌癥的發(fā)生、發(fā)展、轉移和化療抵抗等。HSP-27在一些腫瘤中呈現(xiàn)高表達，包括乳腺癌、神經母細胞瘤、消化道腫瘤等多種惡性腫瘤，并與腫瘤的惡性程度及TNM分期有關［5］。對肝腫瘤組織、健康人及乙型肝炎病毒感染者的血清蛋白質組學研究發(fā)現(xiàn)，在惡性程度高、侵襲性強的肝癌組織及肝癌患者血清中HSP-27呈高表達［6］。有研究表明，在對76例PHC患者的單一診斷及平行診斷中，HSP-27單項的敏感性為59.21%，特異性73.13%，陽性預測值是71.43%，當HSP-27與經典標志物AFP相結合檢測PHC時診斷的敏感性為78.95%，特異性77.61%，陽性預測值是80.00%［7］。本研究結果提示，HSP-27在32例肝癌中的陽性率明顯高于肝硬化，而在肝炎、良性肝臟占位組織中均未見表達，且與癌組織的病理分級及TMN分期有明顯相關性，低分化及晚期轉移性肝癌HSP-27的陽性率明顯偏高，而與肝癌患者的年齡、性別、腫瘤大小、HBsAg定性和AFP定量等因素均無關，這與文獻［8］報道的研究結果相一致，作者推測HSP-27蛋白在肝癌的發(fā)生、發(fā)展及轉移中發(fā)揮重要作用。

GPC-3是一種參與細胞增殖和胚胎發(fā)育的細胞膜糖蛋白，在細胞增殖與分化的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，通過結合胞外基質、生長因子和蛋白酶等對細胞生長分化以及腫瘤形成和轉移起重要作用［9］。Hsu等［10］報道了在191例 PHC組織中，143例（74.8%）能檢測到了GPC-3mRNA，而在156例癌旁“非瘤”肝組織中僅有5例（3.2%）為陽性，該5例均為有門脈或遠處轉移的病例。GPC-3mRNA及其蛋白在PHC組織中的陽性率通常為70%左右，而在正常肝臟、肝臟良性腫瘤、慢性肝炎和肝硬化等中均呈陰性［11-12］。Capurro等［13］研究表明，在29例HCC組織中，21例GPC-3蛋白表達陽性，而在正常肝組織及良性肝病組織中未檢測到GPC-3蛋白，而后用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法檢測血清中GPC-3蛋白，結果發(fā)現(xiàn)在34例HCC患者中有18例（53%）GPC-3蛋白濃度明顯升高，而在20例肝硬化合并慢性肝炎的患者中僅有1例GPC-3蛋白濃度升高。丁光輝等［14］研究發(fā)現(xiàn)，GPC-3mRNA的表達與包膜是否完整、有無癌栓形成、有無肝內轉移、性別、年齡及HBsAg均無關。本研究結果顯示，GPC-3在肝癌中的陽性率為87.5%明顯高于肝硬化組織（陽性率為40%），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），在肝炎、良性肝臟占位組織中均未見表達，同時GPC-3與腫瘤的病理分級、臨床分期、大小、HBsAg定性和AFP定量等無關，與上述研究報道［10-15］相一致，這再次證實了GPC-3與肝癌有著密切的聯(lián)系，表明GPC-3可作為新的肝癌腫瘤標記物。而GPC-3在患者性別、年齡方面的統(tǒng)計學差異有可能與樣本數量較少有關，故進一步的大樣本研究是必要的。

綜上所述，HSP-27和GPC-3在肝癌組織中高表達，而在肝硬化組織中低表達，在肝炎、良性肝臟占位組織中不表達，表明HSP-27和GPC-3與肝癌的發(fā)生、發(fā)展和轉移有著密切聯(lián)系，可成為潛在的肝癌診斷標志物，對提高肝癌的檢出率以及肝癌預后判斷都有重要意義，進一步的研究以明確HSP-27及GPC-3表達調控異常在肝癌發(fā)生中的機制，可能為肝癌的靶向治療開辟新的前景。

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