張 婷，謝 淵，李 毅，單可人，官志忠

（貴陽醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)重點實驗室 550004）

亞甲基四氫葉酸還原酶（methy lenete trahydr of olate reductase，MTHFR）蛋白普遍存在于人、動物及原核生物中，其生化功能是催化5.1 0-亞甲基四氫葉酸到5-甲基四氫葉酸的還原反應(yīng)。MTHFR酶活性的改變會導(dǎo)致5-甲基四氫葉酸的生成障礙，從而導(dǎo)致同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）復(fù)甲基化障礙，使得血漿Hcy濃度升高［1-2］，從而導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生。目前研究較為廣泛的是該酶基因的677C／T和1298A／C多態(tài)位點，已有研究表明其在不同國家、同一國家不同地區(qū)、不同民族或種族中的分布有顯著差異性［3-5］。布依族、侗族、苗族是貴州省人口較多的少數(shù)民族，本研究所選標本采自封閉的自然群體。通過了解貴州布依族、侗族及苗族人群中MTHFR基因677C／T和1298A／C的遺傳多態(tài)性，獲取相關(guān)群體遺傳數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 根據(jù)知情同意的原則，隨機選取貴州世居布依族、侗族、苗族隔離自然人群，樣本總量597例，其中布依族201例，男100例，平均（46.5±14.1）歲，女101例，平均（47.9±14.0）歲；侗族198例，男106例，平均（46.5±18.2）歲，女92例，平均（45.8±17.2）歲；苗族198例，男112例，平均（48.3±12.9）歲，女86例，平均（45.0±10.3）歲。研究對象彼此間無直接血緣關(guān)系，采集受試對象外周靜脈血血樣，EDTA-K2抗凝后，-20℃保存。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采用常規(guī)酚-氯仿抽提法從全血中提取DNA，并將樣品DNA標化為20ng／μL作為模板，-20℃存放備用。

1.2.2 TaqMan-MGB探針基因分型 采用ABI公司的Taq-Man?SNP Genotyping Assays對 MTHFR 677C／T，1298A／C）進行基因分型。反應(yīng)體系10L，包含5LTaqMan?Universal PCR Master Mix，0.25LTaqMan Genotyping Assay，1 μL DNA（20ng／μL），加雙蒸水至10μL。反應(yīng)條件為60℃30s；95℃10min；92℃15s，60℃60s，共40個循環(huán)；60℃30 s。所擴增的目的基因片段由于SNPs位點的堿基不同，標記呈不同的熒光，利用熒光發(fā)光特點，通過Applied Biosystems StepOneTM基因分析儀檢測，StepOneTM軟件分析基因分型結(jié)果。

表1 貴州3個民族MTHFR 677C／T，1298A／C基因型及等位基因頻率分布［n（%）］

1.2.3 測序 用ABI 310型全自動DNA測序儀對兩基因型進行測序驗證。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，應(yīng)用HaploView 4.1軟件進行SNPs的Hardy-Weinberg平衡、LD水平和單倍型結(jié)構(gòu)分析，兩位點LD水平以D′＝1為判斷標準。計數(shù)資料采用率表示，對基因型及等位基因頻率進行χ2檢驗，檢驗水準α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 基因分型結(jié)果 貴州布依族、侗族、苗族人群 MTHFR 677C／T（rs 1801133），1298A／C（rs 1801133）基因型、等位基因頻率分布見表1。在受檢人群中MTHFR 677C／T和1298A／C位點在3個民族之間基因型（χ2＝14.98，P＝0.005）和等位基因頻率（χ2＝14.68，P＝0.001）差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其中布依族與苗族間基因型（χ2＝13.22，P＝0.001）和布依族與侗族、苗族等位基因頻率（χ2＝7.34，P＝0.007；χ2＝12.84，P＝0.000）差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而布依族與侗族間基因型（χ2＝7.60，P＝0.022），侗族與苗族間基因型、等位基因頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；1298A／C位點在3個民族之間基因型（χ2＝0.672，P＝0.955）和等位基因頻率（χ2＝0.336，P＝0.845）差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 貴州3個民族 MTHFR 677C／T，1298A／C位點組合情況 677CC／1298AA雙野生型頻率以布依族最低，分別為布依族21.9%，侗族33.3%，苗族35.4%；677CT／1298CC組合僅存在于侗族；3個民族中均未見677TT／1298CC雙純和突變及677TT／1298AC組合。見表2。

表2 677C／T與1298A／C各基因型在3個民族中的分布［n（%）］

2.3 MTHFR基因677C／T與1298A／C兩位點連鎖情況及單倍型分析結(jié)果 將3個民族樣本MTHFR基因677C／T和1298A／C兩位點構(gòu)建單倍型，發(fā)現(xiàn)主要以3種組合的存在，其分別是：677C-1298A（54.3%）、677C-1298C（27.4%）及677T-1298A（18.0%）。677C／T和1298A／C連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)，布依族和苗族兩位點間存在連鎖不平衡現(xiàn)象（D′＝1）。見表3。

表3 677C／T與1298A／C在3個民族中單倍型分布頻率（%）

3 討 論

MTHFR基因定位于染色體1p36.3［6］，該基因最常見的SNP位點是677C／T及1298A／C。據(jù)報道他們的突變將導(dǎo)致酶的耐熱性和活性減低［7-8］，血漿Hcy水平升高，成為心血管病和神經(jīng)管缺損的獨立風(fēng)險因素。現(xiàn)有資料表明，MTHFR 677C／T的等位基因和基因型分布具有較強的地域和人種特征，突變型T等位基因頻率由低到高依次為非洲人（＜10%）、歐洲白人（25.1%～46.0%）、中東人（17.4%～25.7%）、中國漢族人（21.0%～44.8%，由南向北呈增加趨勢）和墨西哥人（57.0%）?；蛐头植荚诟鞯貐^(qū)或民族均以CC和CT為主［9-11］。本次研究發(fā)現(xiàn)僅有侗族677T等位基因頻率與上述結(jié)論相一致，而侗族和苗族突變頻率相對較低。1298A／C多態(tài)性也同樣存在種族和民族差異性。C等位基因的頻率亞洲為17%～38%，西歐為27%～36%。非洲和北美約30%，中國北方漢族為20%［11-13］。本次研究結(jié)果顯示1298C等位基因頻率與報道相符。

上述兩位點組合情況研究發(fā)現(xiàn)（表2），677CT／1298CC組合僅存在于侗族；677CC／1298AA雙野生型頻率以布依族最低；3個民族中均未見677TT／1298CC雙純和突變及677TT／1298AC組合，這與已報道文獻一致［14］；單倍型主要以677C-1298A（54.3%）出現(xiàn)；同時侗族未見已報道的兩位點連鎖不平衡現(xiàn)象［15-16］。

綜上所述，MTHFR基因677C／T和1298A／C位點在不同民族的分布存在明顯差異。分子生物學(xué)與遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，個體對疾病的易感性不僅與環(huán)境有關(guān)更與不同等位基因?qū)е碌谋磉_改變有關(guān)。而MTHFR與多種疾病的發(fā)生相關(guān)，因此對人群MTHFR基因多態(tài)性的研究有助于進一步弄清人群中突變等位基因頻率，對基因多態(tài)與疾病的關(guān)系做更明確探討提供理論依據(jù)，本研究為此提供有意義的數(shù)據(jù)積累。

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