田 甜，周成旭*，劉寶寧，陳海敏，嚴(yán)小軍

(寧波大學(xué) 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波 315211)

6種海洋微藻β-葡聚糖的累積特征及其免疫活性分析

田 甜，周成旭*，劉寶寧，陳海敏，嚴(yán)小軍

(寧波大學(xué) 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波 315211)

跟蹤檢測(cè)6種海洋微藻在生長(zhǎng)過(guò)程中單位細(xì)胞β-葡聚糖的含量變化，分析其累積時(shí)期、累積速率以及提取制備的得率和純度，并對(duì)幾種微藻來(lái)源的β-葡聚糖進(jìn)行免疫活性檢測(cè)。結(jié)果表明：β-葡聚糖在微藻種群增殖的平臺(tái)期累積量最大，不同種類(lèi)的微藻細(xì)胞累積β-葡聚糖能力差異較大。假微型海鏈藻(Thalassiosira pseudonana)具有較大的累積速率、提取制備得率以及較大的免疫活性。6種海洋微藻來(lái)源的β-葡聚糖都顯示比酵母來(lái)源的β-葡聚糖免疫活性高。

海洋微藻；β-葡聚糖；累積效率；提取率；免疫活性

葡聚糖又稱(chēng)為右旋糖酐，廣泛分布在細(xì)菌、真菌、高等植物體內(nèi)，有α-葡聚糖和β-葡聚糖兩種，α-葡聚糖一般沒(méi)有生物活性，多數(shù)具有明顯生物學(xué)活性的葡聚糖都是β-葡聚糖[1]。不同來(lái)源的β-葡聚糖，其結(jié)構(gòu)和生物活性都存在差異，真菌提取的如酵母β-葡聚糖，主鏈由1,3-β糖苷鍵連接，帶有由1,6-β糖苷鍵連接的分支，具有抗腫瘤活性；高等植物如燕麥β-葡聚糖，不僅帶有1,3-β和1,6-β糖苷鍵，還存在1,4-β糖苷鍵連接的分子內(nèi)連接[2]，具有降低總膽固醇的作用[3]。即使是同種來(lái)源的β-葡聚糖，也可能同時(shí)具有單螺旋、三螺旋或隨機(jī)螺旋等立體構(gòu)象[4]，從而表現(xiàn)多種生物活性，如防護(hù)系統(tǒng)增強(qiáng)劑(HDP)[5]、抗腫瘤[6]、抗感染[7]和免疫調(diào)節(jié)功能。β-葡聚糖既可作為膳食纖維來(lái)源，又是一種優(yōu)質(zhì)的保健食品添加劑，已被正式列入國(guó)家資源產(chǎn)品[8]。

海洋微藻是海洋生態(tài)系統(tǒng)中的最主要初級(jí)生產(chǎn)者，也是海洋生物資源的重要組成部分。海洋微藻生長(zhǎng)速度快，單位面積產(chǎn)量大，相對(duì)于高等植物，可以更有效地利用陽(yáng)光、水和二氧化碳等無(wú)機(jī)物合成有機(jī)物[9]，而且在生產(chǎn)過(guò)程中不占用耕地，是未來(lái)海洋資源開(kāi)發(fā)的重要對(duì)象。糖類(lèi)是海洋微藻重要的代謝產(chǎn)物，海洋微藻多糖除了具有傳統(tǒng)的工業(yè)價(jià)值外，還具有多種生物活性及藥用功能[10]，如增強(qiáng)機(jī)體免疫、抗病毒作用、抗惡性腫瘤、抗炎癥[11-15]。已有分析顯示，來(lái)源于微型藻類(lèi)牟氏角毛藻的β-葡聚糖較市售產(chǎn)品的免疫活性高[16]。綜上所述，從微藻中提取高活性β-葡聚糖有重要科學(xué)意義。

本實(shí)驗(yàn)以微型藻類(lèi)生產(chǎn)β-葡聚糖為目標(biāo)，在實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，對(duì)幾種可以快速增殖的海產(chǎn)微型藻類(lèi)β-葡聚糖的產(chǎn)生規(guī)律、制備產(chǎn)率和產(chǎn)量以及生物活性等進(jìn)行分析，為微藻來(lái)源β-葡聚糖的選種、采收時(shí)機(jī)選擇等方面的研究和生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

藻種及其培養(yǎng)：選取6種海產(chǎn)微藻，均為寧波大學(xué)微藻種質(zhì)庫(kù)保存種質(zhì)。其中硅藻4種：中肋骨條藻(Skeletonema costatum (Greville) Cleve)、角毛藻(Chaetoceros debilis Cleve)、假微型海鏈藻(Thalassiosira pseudonana Hasle & Heimdal)和三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum Bahl.)。金藻2種：等鞭金藻(Isochrysis galbana Parke)和一種顆石藻(Pleurochrysis sp.)。各種微藻在相同的培養(yǎng)條件下，用f/2培養(yǎng)液懸浮培養(yǎng)。培養(yǎng)環(huán)境溫度20℃、光照度2500lx(白天:黑夜=12:12)，每天搖瓶2次。每種藻設(shè)3個(gè)平行組，培養(yǎng)體積800mL，起始培養(yǎng)密度為1.9×105～2.1×105cells/mL。

1.2 試劑與儀器

β-葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品(純度＞95%) 武漢百特純大分子科技有限公司；玻璃纖維濾紙 英國(guó)Whatman公司；小鼠腫瘤壞死因子-α ELISA試劑盒 武漢博士德生物有限公司；小鼠巨噬細(xì)胞(Raw 246.7) 武漢中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；剛果紅 上海遠(yuǎn)航試劑廠；Sephadex G-50美國(guó)Pharmacia公司；其余試劑均為為國(guó)產(chǎn)分析純。

GXZ-128A智能光照培養(yǎng)箱 寧波江南儀器有限公司；酶標(biāo)儀 德國(guó)Thermo公司；UV-7540紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì) 上海欣茂儀器有限公司；TS100倒置生物顯微鏡 日本尼康公司；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；BUCHI R-210/215旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海萬(wàn)捷科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 β-葡聚糖在種群生長(zhǎng)過(guò)程中變化規(guī)律的研究

1.3.1.1 微藻種群生長(zhǎng)過(guò)程跟蹤

以微藻懸浮液光密度值表征種群生長(zhǎng)狀態(tài)，培養(yǎng)微藻至平臺(tái)期，將藻液2倍稀釋成4個(gè)梯度，取200μL各梯度藻液至96孔板，于630nm波長(zhǎng)測(cè)吸光度；同時(shí)用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)對(duì)應(yīng)藻液細(xì)胞密度，設(shè)3個(gè)平行，繪制藻液吸光度和對(duì)應(yīng)細(xì)胞數(shù)的關(guān)系曲線(xiàn)。樣品檢測(cè)時(shí)，取200μL藻液至96孔板，于630nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。比照吸光度與細(xì)胞數(shù)關(guān)系曲線(xiàn)，計(jì)算細(xì)胞數(shù)。隔天取樣，培養(yǎng)至20d。

1.3.1.2 種群生長(zhǎng)過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)β-葡聚糖含量測(cè)定

參考Granum等[17]的方法，制作葡萄糖吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。樣品測(cè)量時(shí)將藻液搖勻，吸取10mL藻液用玻璃纖維濾紙(Whatman CF/C)過(guò)濾，收集濾膜上的藻細(xì)胞。往藻細(xì)胞中加入5mL 0.05mol/L H2SO4，于60℃水浴加熱30min，再用玻璃纖維濾紙過(guò)濾，收集過(guò)濾液。取1mL濾液，于485nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，比照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算相應(yīng)的β-葡聚糖含量。隔天取樣，培養(yǎng)至20d。

1.3.2 β-葡聚糖制備及其得率分析

1.3.2.1 β-葡聚糖的提取制備

按上述條件培養(yǎng)微藻至平臺(tái)期，4℃、4800r/min離心10min，收集藻細(xì)胞，冷凍干燥收集干藻粉。稱(chēng)取一定量的各種藻粉，按照Hirokawa等[18]的方法提取葡聚糖，得到淡黃色蓬松纖維狀葡聚糖粗糖。

參考何貺等[19]的方法：取粗糖溶解后進(jìn)行Sephadex G-50柱層析純化，以純水洗脫，控制流速大約0.25mL/min，每管收集2.5mL分部收集。每管吸取少量收集液用苯酚-硫酸法檢測(cè)，按照管號(hào)對(duì)光密度繪制洗脫曲線(xiàn)，將最大峰處的洗脫液合并，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，冷凍干燥，得到淡黃色粉末狀葡聚糖純糖。

1.3.2.2 β-葡聚糖的含量測(cè)定

剛果紅法測(cè)β-葡聚糖含量：剛果紅與β-葡聚糖反應(yīng)具有高度專(zhuān)一性，形成有色物質(zhì)，當(dāng)反應(yīng)條件一致時(shí)，溶液中β-葡聚糖含量在一定范圍內(nèi)吸光度變化與β-葡聚糖濃度成正比[20]，本研究以剛果紅法檢測(cè)粗糖樣品中β-葡聚糖純度。參考張娟等[21]的方法制作葡聚糖光密度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，樣品檢測(cè)時(shí)稱(chēng)取0.005g樣品，加少量去離子水，70℃水浴助溶，再加去離子水至體積為10mL配成500μg/mL的樣品液，冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?。測(cè)量時(shí)，取80μL的樣品液，添加去離子水至體積為1mL，配成40μg/mL葡聚糖溶液，再加入2mL剛果紅溶液，20℃水浴加熱30min后取1mL于545nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，比照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品液β-葡聚糖含量。

1.3.3 β-葡聚糖免疫活性檢測(cè)

1.3.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

取小鼠巨噬細(xì)胞Raw 264.7細(xì)胞液1mL/孔于24孔板，37℃培養(yǎng)24h，控制細(xì)胞數(shù)為2×105cells/mL，再依次加入5、10、20μL 10mg/mL β-葡聚糖溶液，形成50、100、200μg/mL的質(zhì)量濃度梯度，留一個(gè)孔的細(xì)胞液不加葡聚糖作空白對(duì)照，培養(yǎng)24h后取出備用。

1.3.3.2 免疫活性檢測(cè)

收集細(xì)胞液，4℃、5000r/min離心5min，取上清液，按照小鼠腫瘤壞死因子-α ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作ELISA實(shí)驗(yàn)。每組做2個(gè)平行。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用x±s表示。

圖1 6種海產(chǎn)微藻培養(yǎng)增殖過(guò)程中細(xì)胞數(shù)和單位細(xì)胞β-葡聚糖含量變化特征Fig.1 Population growth and cellular β-glucan content variations in different species of marine microalgae

2 結(jié)果與分析

2.1 微藻培養(yǎng)過(guò)程中β-葡聚糖含量變化特征

由圖1可知，比較6種海洋微藻在種群生長(zhǎng)過(guò)程中單位細(xì)胞β-葡聚糖含量變化趨勢(shì)，受初始接種微藻狀態(tài)的影響，種群生長(zhǎng)初期即在新的營(yíng)養(yǎng)條件下都表現(xiàn)為胞內(nèi)β-葡聚糖降低，指數(shù)增長(zhǎng)期中出現(xiàn)β-葡聚糖的最低值，以后各藻細(xì)胞中β-葡聚糖逐漸累積，到平臺(tái)期后期或衰亡期β-葡聚糖累積得最多。在進(jìn)入平臺(tái)后期(或衰亡期)后，三角褐指藻、假微型海鏈藻和等鞭金藻細(xì)胞內(nèi)β-葡聚糖含量持續(xù)增加，中肋骨條藻、角毛藻和顆石藻單位細(xì)胞β-葡聚糖含量的增加則趨于平緩。顯示了不同種類(lèi)對(duì)β-葡聚糖的代謝利用特征上的差異。

表1 海產(chǎn)微藻單位細(xì)胞β-葡聚糖含量最小、最大值及累積倍增效率Table1 Maximum and minimum contents and cumulative doubling efficiency of β-glucans from different species of marine microalgae at the same culture

進(jìn)一步分析各種增殖培養(yǎng)過(guò)程中β-葡聚糖從最小值至最大值的累積效率。從表1可以看出，在相同培養(yǎng)條件下，不同微藻β-葡聚糖的累積量差異明顯。分析微藻種群增殖過(guò)程中，單位細(xì)胞β-葡聚糖含量從最低到最高變化過(guò)程發(fā)現(xiàn)，假微型海鏈藻單位β-葡聚糖增加倍數(shù)最大，為1002.5%，增加速率最快，平均達(dá)71.61%/d，而其他微藻的增加倍率在200%～500%之間。顯示假微型海鏈藻細(xì)胞β-葡聚糖與生長(zhǎng)代謝關(guān)系密切，利用其生產(chǎn)β-葡聚糖的可調(diào)節(jié)程度高。

2.2 β-葡聚糖的得率和純度分析

得率和純度都能反映提取方法的提取效率。由表2可見(jiàn)，中肋骨條藻、三角褐指藻、角毛藻和等鞭金藻提取β-葡聚糖的得率在0.2%以上、純度在91%以上，假微型海鏈藻和顆石藻提取β-葡聚糖的得率分別為0.346%和0.329%，純度分別為93.99%和94.21%，相對(duì)于其他微藻的得率和純度都較高?？傮w來(lái)說(shuō)，6種海產(chǎn)藻β-葡聚糖提取得率、純度跟平均值比較差距相對(duì)不大，可能是因?yàn)樘崛》椒ㄒ粯?。關(guān)于β-葡聚糖提取的方法較多，主要的提取方法有酸堿法[22]、酶法[23]等，比較Wood等[24]溫和堿法提取燕麥β-葡聚糖的得率達(dá)0.7%，純度低于90%，本提取方法提取β-葡聚糖的純度較高，提取得率卻比較低，今后需要改進(jìn)提取條件進(jìn)一步提高得率。

表2 海產(chǎn)微藻β-葡聚糖提取效率Table2 Extraction efficiency ofβ-glucans from different species of marine microalgae

2.3 β-葡聚糖免疫活性檢測(cè)

腫瘤壞死因子(TNF-α)是目前發(fā)現(xiàn)的抗腫瘤活性最強(qiáng)的細(xì)胞因子，它可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。很多細(xì)胞都可以合成TNF-α，包括各種免疫細(xì)胞，如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞等。將不同濃度的海洋微藻β-葡聚糖作用于小鼠單核巨噬細(xì)胞(RAW246.7)，通過(guò)ELISA實(shí)驗(yàn)觀察β-葡聚糖誘導(dǎo)TNF-α生成量的變化，結(jié)果如圖2所示。

圖2 6種海洋微藻的生成量Fig.2 Production of TNF-α induced by β-glucans at different concentrations from different species of marine microalgaeβ-葡聚糖在不同濃度下誘導(dǎo)TNF-α

將6種海產(chǎn)微藻β-葡聚糖作用于小鼠巨噬細(xì)胞均誘導(dǎo)TNF-α生成量的增加，由此可以推測(cè)海產(chǎn)微藻β-葡聚糖有具有激活巨噬細(xì)胞、促進(jìn)細(xì)胞因子合成和抗腫瘤等生物學(xué)活性[25]。比較不同質(zhì)量濃度β-葡聚糖對(duì)Raw264.7細(xì)胞生成TNF-α量的影響，不同微藻來(lái)源的β-葡聚糖有質(zhì)量濃度相關(guān)的不同效應(yīng)。對(duì)中肋骨條藻和顆石藻來(lái)源而言，TNF-α生成量隨β-葡聚糖質(zhì)量濃度增加而增加，在200μg/mL時(shí)TNF-α生成量最大；角毛藻和假微型海鏈藻的β-葡聚糖質(zhì)量濃度在100μg/mL時(shí)TNF-α生成量達(dá)到飽和，β-葡聚糖質(zhì)量濃度為200μg/mL TNF-α生成量跟100μg/mL沒(méi)有顯著差別；三角褐脂藻和等鞭金藻的β-葡聚糖質(zhì)量濃度為100μg/mL時(shí)TNF-α生成量最大，當(dāng)質(zhì)量濃度為200μg/mL TNF-α生成量反而下降，顯示了免疫抑制的特點(diǎn)。

由圖3可知，比較相同質(zhì)量濃度(100μg/mL)的幾種海洋微藻β-葡聚糖誘導(dǎo)TNF-α增加量，三角褐指藻來(lái)源的β-葡聚糖活性最大，角毛藻來(lái)源的β-葡聚糖活性最小，其他微藻來(lái)源的β-葡聚糖誘導(dǎo)TNF-α生成量在600～700pg/mL。與陳璐等[26]100μg/mL酵母β-葡聚糖誘導(dǎo)TNF-α最大增加量為232.18pg/mL相比，相同濃度海洋微藻β-葡聚糖誘導(dǎo)TNF-α增加量是酵母β-葡聚糖的2.5～3.2倍，所以海洋微藻來(lái)源的β-葡聚糖抗腫瘤活性高于酵母β-葡聚糖。

增加量的比較Fig.3 Comparison of TNF-α production induced by 100 μg/mL β-glucans from different origins圖3 100μg/mL不同來(lái)源的β-葡聚糖誘導(dǎo)TNF-α

3 結(jié) 論

3.1 海產(chǎn)微藻細(xì)胞的β-葡聚糖在種群增殖過(guò)程中都發(fā)生變化，在平臺(tái)后期達(dá)到最大累積。

3.2 由于海洋微藻生長(zhǎng)及代謝的差異，使不同海洋微藻在種群生長(zhǎng)過(guò)程中β-葡聚糖的累積特征和累積效率有所差別，并且其免疫活性也有所不同。但相同質(zhì)量濃度下，海產(chǎn)微藻來(lái)源β-葡聚糖的免疫活性均比酵母來(lái)源的β-葡聚糖活性高。

3.3 假微型海鏈藻β-葡聚糖的累積速率和提取效率明顯高于其他海洋微藻；三角褐指藻提取的β-葡聚糖免疫活性最高，這兩種藻都可能成為今后β-葡聚糖重要的微藻來(lái)源。

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Accumulation Features and Immuno-stimulative Effects of β-Glucans from Six Species of Marine Microalgae

TIAN Tian，ZHOU Cheng-xu*，LIU Bao-ning，CHEN Hai-min，YAN Xiao-jun
(Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology, Ministry of Education, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

The accumulation features of microalgal β-glucans, including accumulation phase and rate, have been characterized by monitoring the content of β-glucans from six marine microalgae during their growth cycles. The extraction and immuno-stimulative effects of β-glucans were also studied. The results indicated that the content of cellular β-glucans reached the maximum level at stationary phase for all microalgae, however, with large variation depending on species. Among six microalgae, Thalassiosira pseudonana showed outstanding features for its β-glucans with high accumulation rate, isolation yield, and significant immuno-stimulative effects. Therefore, the immuno-stimulative effects of β-glucans were higher from microalgae than that from yeast.

marine microalgae；β-glucans；accumulative rate；extraction rate；immune activity

Q945.79

A

1002-6630(2013)03-0188-05

2012-10-20

教育部“長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃”項(xiàng)目(IRT0734)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31172448)；浙江省重點(diǎn)基金項(xiàng)目(Z3100565)；浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(LY12D06001)；海洋可再生能源專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目(GHME2001SW02)；國(guó)家公益性行業(yè)(海洋)科研專(zhuān)項(xiàng)(201105009)

田甜(1987—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑿驮孱?lèi)生理生態(tài)學(xué)。E-mail：liazajoy@163.com

*通信作者：周成旭(1968—)，女，副研究員，碩士，研究方向?yàn)楹Ｑ笪⑿驮孱?lèi)的基礎(chǔ)研究及應(yīng)用。E-mail：zhouchengxu@nbu.edu.cn