王四華，黃可君，張光亞

（華僑大學(xué) 化工學(xué)院，福建 廈門361021）

嗜鹽菌是一類生活在鹽域環(huán)境中的微生物，主要生長在鹽湖、鹽沼、死海和鹽場等環(huán)境中，Kushner等［1］將其分為弱嗜鹽菌、中度嗜鹽菌和極端嗜鹽菌.嗜鹽菌體內(nèi)的蛋白酶不僅能耐受一定的鹽離子強(qiáng)度，而且必需依靠一定的鹽離子強(qiáng)度來維持其結(jié)構(gòu)與功能的穩(wěn)定 .對(duì)于極端嗜鹽菌如嗜鹽古生菌，其體內(nèi)的酶可在鹽濃度高達(dá)5.2 mol·L-1的環(huán)境下保持活性和穩(wěn)定性［2］，而在低鹽濃度下，嗜鹽古生菌體內(nèi)的蛋白質(zhì)會(huì)變性失活［3］.研究表明：嗜鹽菌主要依靠兩條途徑來維持胞內(nèi)滲透壓平衡［4-6］，其一是細(xì)胞中聚集無機(jī)鹽離子如K＋，其二是聚集相容性物質(zhì)如甜菜堿和四氫嘧啶等.盡管如此，有關(guān)嗜鹽蛋白嗜鹽機(jī)理尚未有確切的解釋，而從原子層面系統(tǒng)了解蛋白分子在高鹽條件下的動(dòng)力學(xué)行為的研究也非常匱乏 .美國華盛頓大學(xué)Daggett教授的研究團(tuán)隊(duì)提出了動(dòng)力組學(xué)（dynameomics）概念，并建立了動(dòng)力組學(xué)數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站（http：／／www.dynameomics.org）［7］，通過對(duì)一批具有代表性的蛋白質(zhì)進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，以達(dá)到從原子尺度來理解蛋白質(zhì)的功能和穩(wěn)定性.分子動(dòng)力學(xué)模擬越來越多地被應(yīng)用于分子生物學(xué)方面，被用來理解、預(yù)測、模擬蛋白質(zhì)、核酸的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，以及模擬DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)等［8］.用分子動(dòng)力學(xué)模擬的方法研究了嗜熱蛋白與常溫蛋白的分子動(dòng)力學(xué)特性，可以從更微觀的層面上探究嗜熱與常溫蛋白在結(jié)構(gòu)柔韌性上的差異［9-11］.然而，目前尚未見利用分子動(dòng)力學(xué)模擬及組學(xué)的方法來探究嗜鹽蛋白穩(wěn)定性機(jī)理的報(bào)道 .本文通過對(duì)4組嗜鹽蛋白及其同源非嗜鹽蛋白的比較分子動(dòng)力組學(xué)，模擬研究來闡明嗜鹽酶的嗜鹽機(jī)理.

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取

所利用的4組目標(biāo)蛋白分別為二氫葉酸還原酶、蘋果酸脫氫酶、堿性磷酸酶和核苷二磷酸激酶，每組分別包含一個(gè)嗜鹽蛋白及其同源的非嗜鹽蛋白.從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（PDB）中獲取目標(biāo)蛋白，且這4組中的嗜鹽蛋白在數(shù)據(jù)庫（PDB）中的ID號(hào)分別為1VDR［12］，2J5R［13］，2X98［14］和2ZUA［15］，對(duì)應(yīng)的4個(gè)非嗜鹽蛋白的ID號(hào)分別為7DFR［16］，1UXI［17］，1Y6V［18］和2VU5［19］.因每組（嗜鹽與非嗜鹽）蛋白均為同一種酶，且它們蛋白質(zhì)序列和空間結(jié)構(gòu)非常相似，因此可以用來進(jìn)行比較分子動(dòng)力學(xué)模擬，以達(dá)到探究嗜鹽酶穩(wěn)定性機(jī)理的目的.

1.2 模擬方法

4組目標(biāo)蛋白中的2J5R和2ZUA均含有4條鏈（A，B，C，D），1VDR，2X98，1Y6V及1UXI均含有兩條鏈（A，B），7DFR及2VU5只含有一條鏈（A）.分別只選取其中的一條鏈（A鏈）作為模擬對(duì)象，并將結(jié)構(gòu)中多余的水分子去除；然后，將所有構(gòu)建的體系分別置入同樣大小的立方水體中，并中和每個(gè)體系的電荷，使得所有體系均為電中性.8條鏈所含氨基酸數(shù)目及體系最后所包含的原子數(shù)，如表1所示.

表1 8條A鏈所含氨基酸數(shù)目及體系最后所包含的原子數(shù)Tab.1 Amino acid number of eight A chains and the atomic number of the final system

將得到的8組體系分別進(jìn)行10 ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬，一共進(jìn)行了80 ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬.所使用的分子動(dòng)力學(xué)模擬軟件為NAMD［20］及與之相匹配的可視化軟件VMD［21］，選用CHARMm格式力場［22］，所有模擬均在常壓（101.325 k Pa）和常溫（310 K）下進(jìn)行，且分別采用Langevin Piston和 Langevin Thermostat方法控制壓力和溫度波動(dòng).采用PME［23］方法計(jì)算長程靜電引力，非鍵相互作用力采用勢能截?cái)?，截?cái)喟霃綖?.35 nm，對(duì)體系使用周期邊界條件，使用SHAKE算法使水分子保持剛性.時(shí)間步長為2 fs，每1 ps輸出一次計(jì)算結(jié)果，所有模擬均在等溫等壓系綜下進(jìn)行.

2 結(jié)果與分析

2.1 兩類酶的分子動(dòng)力學(xué)模擬所得參數(shù)分析

兩類酶（嗜鹽與非嗜鹽）的溶劑可及性表面、鹽橋、氫鍵（蛋白質(zhì)分子內(nèi)部及與水溶液形成的氫鍵）、末端距、回旋半徑等參數(shù)，如表2所示.由表2可知：只有2X98所行成的鹽橋比1Y6V的要少，這一反常差異可能是由于2X98與1Y6V氨基酸數(shù)目差異太大（二者相差19個(gè)氨基酸）造成的.除此之外，總體而言，嗜鹽蛋白所形成的鹽橋數(shù)目均比非嗜鹽蛋白多，鹽橋能消除鹽離子的屏蔽效應(yīng)，使分子結(jié)構(gòu)具有剛性，對(duì)維持酶和蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定起決定性作用.因此，可假定為嗜鹽酶為了在高鹽環(huán)境下維持其自身結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，所形成的鹽橋數(shù)目比非嗜鹽酶多.

表2 嗜鹽酶與非嗜鹽酶之間各參數(shù)的比較Tab.2 Various parameters comparison of halophilic enzyme and non-halophilic enzyme

從數(shù)據(jù)上看，嗜鹽酶另一突出特點(diǎn)，無論是其蛋白質(zhì)分子內(nèi)所形成的氫鍵還是蛋白質(zhì)與外界水環(huán)境所形成的氫鍵，都比非嗜鹽酶明顯要多.有文獻(xiàn)［24-25］表明，嗜鹽酶所富含的酸性氨基酸殘基可加強(qiáng)蛋白質(zhì)與溶劑間的相互作用，為了適應(yīng)高鹽環(huán)境，嗜鹽蛋白通過加強(qiáng)與溶劑間的水合能力來維持其結(jié)構(gòu)與功能的穩(wěn)定.對(duì)于嗜鹽蛋白分子內(nèi)所形成的氫鍵較非嗜鹽蛋白多，這可假定為分子內(nèi)的氫鍵在一定程度上可維持自身結(jié)構(gòu)的剛性，因此也有利于嗜鹽蛋白適應(yīng)外界高鹽環(huán)境.

文獻(xiàn)［26］通過定點(diǎn)突變的方法發(fā)現(xiàn)，嗜鹽蛋白通過降低其自身的溶劑可及性表面的機(jī)制來適應(yīng)細(xì)胞外的高鹽環(huán)境 .比較表2數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)：嗜鹽酶的溶劑可及性表面確實(shí)比非嗜鹽酶的要小，在高鹽缺水的環(huán)境下形成這一機(jī)制對(duì)嗜鹽菌的生命活動(dòng)是非常有利的.

末端距是用來表征蛋白質(zhì)分子N端和C端的距離，回旋半徑可用來表示蛋白質(zhì)分子的緊密度.在這兩項(xiàng)數(shù)值上，嗜鹽酶同樣比非嗜鹽酶要小，這說明嗜鹽酶在總體結(jié)構(gòu)上較為緊密，嗜鹽酶結(jié)構(gòu)上的緊湊更有利于在高鹽環(huán)境下維持其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定.

2.2 兩類酶分子均方根偏差值的比較

均方根偏差（RMSD）是指模擬過程中兩種蛋白質(zhì)各部分原子偏離平均位置的程度，也就是原子運(yùn)動(dòng)幅度的大小，其值越大說明運(yùn)動(dòng)越劇烈，反映了蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的剛性與柔性.圖1為4組蛋白酶分子的RMSD值的比較.

從圖1可知：4組酶中嗜鹽酶的RMSD值均比非嗜鹽的要小，嗜鹽酶在結(jié)構(gòu)上比非嗜鹽酶更加剛性，這種特性也更加有利于其在高鹽環(huán)境下保持結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定.文獻(xiàn)［10］通過分子動(dòng)力學(xué)模擬的方法研究了嗜熱酶與常溫酶的穩(wěn)定性機(jī)理，發(fā)現(xiàn)所研究的嗜熱酶比常溫酶的結(jié)構(gòu)更具有剛性.對(duì)于是否大多數(shù)極端酶如嗜鹽、嗜熱、嗜壓等結(jié)構(gòu)均更具有剛性，則有待于進(jìn)一步研究.

圖1 蛋白酶分子的均方根偏差值比較Fig.1 Comparison of RMSD of the four group protein enzymes

2.3 兩類酶各個(gè)氨基酸殘基柔性比較

圖2為4組蛋白質(zhì)酶分子的每個(gè)氨基酸殘基的RMSD值，可以直觀地反應(yīng)出具體部位的氨基酸殘基數(shù)（n）波動(dòng)幅度.從圖2可知：非嗜鹽酶氨基酸殘基波動(dòng)幅度比嗜鹽酶要大，這與蛋白質(zhì)整體的RMSD波動(dòng)趨勢相符.為了能更清楚區(qū)分嗜鹽酶殘基與非嗜鹽酶殘基的RMSD值的差異，將嗜鹽酶殘基的RMSD值減去非嗜鹽酶殘基的RMSD值，得到另一曲線，用diff-RMSD表示（圖2）.

比較1VDR與7DFR的每個(gè)殘基波動(dòng)情況，可發(fā)現(xiàn)7DFR在殘基15～20上的RMSD值明顯比1VDR要大，且二者在殘基100～120間波動(dòng)幅度均較小.很明顯，1UXI在殘基80～90上的RMSD值比2J5R要高出很多，而在殘基65～70，95～110之間的RMSD值比2J5R卻要小.比較2ZUA與2VU5的每個(gè)殘基波動(dòng)情況，可發(fā)現(xiàn)在殘基40～60間2VU5對(duì)應(yīng)殘基波動(dòng)幅度更大，同時(shí)發(fā)現(xiàn)二者C端的波動(dòng)都很劇烈.1Y6V在N端及殘基85～90，270～300，400～420區(qū)間上的RMSD值比2X98明顯高出很多，而2X98在60～65殘基上的RMSD值比1Y6V大.通過比較分析，發(fā)現(xiàn)非嗜鹽酶多個(gè)部位的氨基酸殘基柔性比嗜鹽酶的要大很多，二者間的這些差異可能就是導(dǎo)致它們適應(yīng)不同生長環(huán)境的一個(gè)因素.

圖2 每個(gè)氨基酸殘基的柔性Fig.2 The flexibility of the amino acids

2.4 兩類核苷二磷酸激酶三維結(jié)構(gòu)的比較

為了進(jìn)一步了解兩類酶在三維結(jié)構(gòu)上的差異，以核苷二磷酸激酶為例，對(duì)兩類核苷二磷酸激酶進(jìn)行高級(jí)結(jié)構(gòu)的比對(duì).通過在線結(jié)構(gòu)比對(duì)工具（http：∥bioinfo3d.cs.tau.ac.il／MultiProt），對(duì)2ZUA 和2VU5的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)二者除了在氨基酸40～60處有差異外，其他部位基本相疊合.比較圖2中二者氨基酸殘基柔性大小，可以發(fā)現(xiàn)在氨基酸40～60間二者出現(xiàn)了較大差異 .從圖2中可看出：在氨基酸40～60處，2VU5的氨基酸殘基柔性比2ZUA明顯要大.

圖3 2ZUA與2VU5三維結(jié)構(gòu)的比較Fig.3 Comparison of three-dimensional structure of 2ZUA and 2VU5

巧合的是，通過比較二者的三維結(jié)構(gòu)可發(fā)現(xiàn)它們正好在氨基酸40～60處出現(xiàn)明顯的差異，如圖3白色圓圈所示，二者在這一區(qū)域基本上為螺旋結(jié)構(gòu) .經(jīng)仔細(xì)比較發(fā)現(xiàn)，2ZUA的螺旋結(jié)構(gòu)比2VU5的更加緊湊，從而導(dǎo)致2ZUA的螺旋結(jié)構(gòu)整體上比2VU5的要短.

二者這一區(qū)域的差異可能是導(dǎo)致它們適應(yīng)不同生長環(huán)境的一個(gè)重要原因，2ZUA的螺旋結(jié)構(gòu)更加緊湊可能會(huì)使得其結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，從而能適應(yīng)外界高鹽環(huán)境.有趣的是，這一區(qū)域非常接近酶的活性中心，而是否與活性中心相互作用且二者的差異是否會(huì)導(dǎo)致引起二者活性中心的差異，以及二者的差異是否會(huì)導(dǎo)致它們整體結(jié)構(gòu)上的差異，從而表現(xiàn)出不同的特性，有待于進(jìn)一步研究.

3 討論

有文獻(xiàn)［27-28］報(bào)道嗜鹽酶的酸性氨基酸含量比非嗜鹽酶多，來自多個(gè)物種的嗜鹽蛋白的平均等電點(diǎn)值為5.嗜鹽蛋白分子表面帶負(fù)電氨基酸殘基較多［29-30］，為了適應(yīng)高濃度鹽環(huán)境，嗜鹽菌經(jīng)過長期的進(jìn)化導(dǎo)致其體內(nèi)的蛋白質(zhì)分子的疏水核心區(qū)較?。?1］.嗜鹽蛋白表面的某些氨基酸與水合離子相互作用，有利于維持其構(gòu)相的穩(wěn)定［32-34］.許多嗜鹽蛋白的亞基表面存在一些特殊的鹽離子結(jié)合位點(diǎn)［21］，嗜鹽酶與溶液中鹽離子的結(jié)合一定程度上可以使其結(jié)構(gòu)在高鹽環(huán)境下保持穩(wěn)定.對(duì)嗜鹽硫解酶進(jìn)行的研究表明：為了適應(yīng)高鹽環(huán)境，嗜鹽硫解酶在一定范圍內(nèi)優(yōu)先使用較小側(cè)鏈的氨基酸，而在高鹽溶液中，使用較小氨基酸殘基能夠明顯降低分子的表面張力，有利于增加分子的靈活性［35］.

理解嗜鹽酶的嗜鹽機(jī)理更有利于將嗜鹽酶應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中.Selim等［36］利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)來研究一株中度嗜鹽菌的嗜鹽機(jī)理，發(fā)現(xiàn)在不同梯度的鹽離子強(qiáng)度下該菌機(jī)體內(nèi)所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)種類有很大差異.嗜鹽菌在環(huán)境生物治理、生物電子和醫(yī)藥工業(yè)等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景［37-39］，其中的嗜鹽酶也具有重大的應(yīng)用價(jià)值.以色列Mevarechy研究小組將嗜鹽的蘋果酸脫氫酶和二氫葉酸酶基因在大腸桿菌中表達(dá)成功［40］.文獻(xiàn)［41］探索把嗜鹽極酶用到提高從油井提取原油量的方法中，用嗜鹽極酶可以分解掉瓜兒豆膠的粘性.

文中借鑒華盛頓大學(xué)Daggett教授的“動(dòng)力組學(xué)”這一理念，分析了4組嗜鹽蛋白及非嗜鹽蛋白的動(dòng)力學(xué)特性，從原子尺度來探究嗜鹽酶的穩(wěn)定性機(jī)理.對(duì)模擬得到的4組酶的運(yùn)動(dòng)軌跡進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)相比非嗜鹽酶，嗜鹽酶能形成更多的鹽橋和氫鍵（無論是分子內(nèi)氫鍵還是與溶劑所形成的氫鍵）.鹽橋及分子內(nèi)的氫鍵在整體上能維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，這對(duì)在高鹽環(huán)境中嗜鹽酶保持其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定是有利的.與溶劑形成較多的氫鍵，和文獻(xiàn)［24-25］報(bào)道的嗜鹽酶可加強(qiáng)與溶劑間的相互作用相符.

嗜鹽酶的溶劑可及性表面較非嗜鹽酶小，通過分析RMSD值、末端距及回旋半徑等值發(fā)現(xiàn)嗜鹽酶在結(jié)構(gòu)上更具剛性，這一特性在應(yīng)對(duì)外界高鹽環(huán)境是非常有利的.通過比較分析發(fā)現(xiàn)，4組酶中非嗜鹽酶很多部位的氨基酸殘基柔性比嗜鹽酶明顯要大，猜測正是這一特性才導(dǎo)致嗜鹽酶與非嗜鹽酶適應(yīng)不同的生長環(huán)境.

利用分子動(dòng)力學(xué)模擬提供了一種新的研究嗜鹽蛋白穩(wěn)定性機(jī)理的方法，可為今后其他研究工作提供良好的借鑒.目前實(shí)驗(yàn)所得嗜鹽蛋白晶體結(jié)構(gòu)較少，僅收集到4組同源蛋白，雖然可以得到一些共性的規(guī)律，但隨著蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫的不斷發(fā)展，相信今后可獲得更多的樣本，進(jìn)行更大規(guī)模的蛋白質(zhì)動(dòng)力組學(xué)研究，使得所得的規(guī)律更具代表性，相關(guān)研究仍需不斷深入.

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