·論 著·

高血壓性腦出血患者血漿循環(huán)DNA與纖維蛋白原相關(guān)性研究

趙召霞1，高 虹2，徐運(yùn)強(qiáng)3，劉 蓓3，王榮霞3，潘世揚(yáng)4

（1.河北省石家莊市第五醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北石家莊050021；2.河北省石家莊市第四醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北石家莊050011；3.河北省石家莊市第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北石家莊050051；4.江蘇省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇南京210029）

目的探討高血壓性腦出血患者血漿循環(huán)DNA與纖維蛋白原的相關(guān)性。方法 采集30例高血壓性腦出血患者發(fā)病后24h靜脈血，采用雙重?zé)晒舛縋CR技術(shù)檢測(cè)血漿循環(huán)DNA水平，并同時(shí)檢測(cè)血漿纖維蛋白原水平。采集30例健康體檢者靜脈血作為對(duì)照組。結(jié)果 腦出血患者血漿循環(huán)DNA水平（313.2±224.7）mg/L，顯著高于對(duì)照組的（26.1±5.9）mg/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。腦出血患者輕、中、重度3組血漿循環(huán)DNA水平之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），重度組血漿循環(huán)DNA水平顯著高于輕度組和中度組（P＜0.05），中度組顯著高于輕度組（P＜0.05）。腦出血患者血漿纖維蛋白原水平（4.25±1.51）g/L，顯著高于對(duì)照組的（2.76±0.85）g/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；重度組血漿纖維蛋白原水平顯著高于輕度組和中度組（P＜0.05）；中度組與輕度組間血漿纖維蛋白原水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。腦出血患者血漿循環(huán)DNA水平與其纖維蛋白原水平呈顯著正相關(guān)（r=0.632，P＜0.05）。結(jié)論 血漿循環(huán)DNA可作為反映高血壓性腦出血后腦組織細(xì)胞損傷及嚴(yán)重程度的靈敏指標(biāo)。

顱內(nèi)出血，高血壓性；纖維蛋白原；診斷

循環(huán)DNA（circulating DNA）是存在于血液（血漿或血清）、滑膜液、腦脊液等體液中的細(xì)胞外DNA，目前國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道血漿中循環(huán)DNA水平的高低與創(chuàng)傷和感染的嚴(yán)重程度相關(guān)，高水平循環(huán)DNA預(yù)示著臨床的高病死率。高血壓性腦出血發(fā)病率高，預(yù)后差，雖然一些臨床評(píng)分可預(yù)測(cè)腦出血的預(yù)后，但仍缺乏可靠的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)指導(dǎo)臨床醫(yī)生作出正確判斷。本研究檢測(cè)高血壓性腦出血患者早期血漿循環(huán)DNA和纖維蛋白原水平，旨在探討其在腦出血患者中的相關(guān)性以及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選取2010年10月—2011年5月在河北省石家莊市第二醫(yī)院住院的高血壓性腦出血患者30例，診斷符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)第4次全國(guó)腦血管病會(huì)議制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)［1］，其中男性20例，女性10例，年齡41～64歲，平均（50.9±9.2）歲。所有患者經(jīng)頭顱 CT檢查證實(shí)有顱內(nèi)出血，出血量10～120mL，平均（45.6±23.8）mL。病情輕重參照腦卒中患者臨床神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)估，其中輕度9例，中度13例，重度8例。所有患者排除發(fā)病前并發(fā)急慢性感染、腫瘤、免疫性疾病等。選擇同期健康體檢者30例作為對(duì)照組，其中男性19例，女性11例，年齡40～60歲，平均（49.3±1.9）歲。2組性別、年齡差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 血漿標(biāo)本的采集和保存：采集健康體檢者和高血壓性腦出血患者發(fā)病24h內(nèi)靜脈血2mL，乙二胺四乙酸抗凝，3 000r/min離心10min，吸取上清于1.5mL離心管中，16 000 r/min離心10min，吸取上層無(wú)細(xì)胞血漿200μL，置于含有5.0×104拷貝重組質(zhì)粒0.2mL離心管（江蘇省人民醫(yī)院潘世揚(yáng)教授饋贈(zèng)）中，充分混勻后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 血漿循環(huán)DNA的提取：采用磁珠法同步提取血漿DNA和重組質(zhì)粒，試劑盒由上海浩源生物有限技術(shù)公司提供。

1.2.3 熒光定量PCR檢測(cè)血漿循環(huán)DNA：采用雙重?zé)晒舛縋CR技術(shù)檢測(cè)提取的血漿DNA和重組質(zhì)粒，檢測(cè)方法參見(jiàn)文獻(xiàn)［2］。試劑盒由江蘇省人民醫(yī)院潘世揚(yáng)教授饋贈(zèng)。

1.2.4 血漿纖維蛋白原的檢測(cè)：抽取外周血2mL，加入1∶9枸櫞酸鈉抗凝試管中混勻，3 000 r/min離心10min，分離出血漿，用日本Sysmex CA1500型血凝儀測(cè)定血漿纖維蛋白原水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以±s表示，分別采用單因素方差分析、q檢驗(yàn)及t檢驗(yàn)；相關(guān)性采用Pearson直線相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 血漿循環(huán)DNA水平比較：高血壓性腦出血患者血漿循環(huán)DNA水平顯著高于對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。腦出血患者輕、中、重度3組血漿循環(huán) DNA水平之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 19.362，P＜0.05）。腦出血患者重度組血漿循環(huán)DNA水平顯著高于輕度組和中度組，中度組顯著高于輕度組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 血漿纖維蛋白原水平變化：高血壓性腦出血患者血漿纖維蛋白原水平顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。高血壓性腦出血患者重度組血漿纖維蛋白原水平顯著高于輕度組和中度組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；中度組與輕度組間血漿纖維蛋白原水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

Groups n Circulating DNA（mg/L）Fibrinogen（g/L）Control 30 26.1±5.9 2.76±0.85 Intracerebral hemorrhage 30 313.2±224.7* 4.25±1.51*Mild 9 73.4±20.8 2.89±1.23 Moderate 13 264.4±88.7# 3.21±1.36 Severe 8 546.2±152.9#△ 5.29±2.31#△

2.4 血漿循環(huán)DNA水平與纖維蛋白原水平相關(guān)性分析：高血壓性腦出血患者血漿循環(huán)DNA水平與其纖維蛋白原水平呈顯著正相關(guān)（r=0.632，P＜0.05）。

3 討 論

現(xiàn)代社會(huì)腦卒中發(fā)病率、致殘率均較高，嚴(yán)重威脅著中老年人的健康。高血壓性腦出血病理生理機(jī)制復(fù)雜，腦出血后引起機(jī)體及腦組織局部一系列病理生理反應(yīng)。腦出血后，除血腫本身的占位性損害外，血腫對(duì)周?chē)X組織的直接破壞和繼發(fā)性腦損傷是影響預(yù)后的重要因素。腦出血后血凝塊釋放大量凝血酶，后者與表達(dá)在腦組織神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞上的凝血酶受體結(jié)合，通過(guò)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致細(xì)胞膜功能或結(jié)構(gòu)的破壞，最終不但可通過(guò)細(xì)胞毒作用直接損害神經(jīng)細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，還能破壞血腦屏障，形成腦水腫［3］。細(xì)胞凋亡、腦水腫和DNA損傷均能導(dǎo)致細(xì)胞核內(nèi)核酸釋放致外周血中。循環(huán)DNA是一種無(wú)細(xì)胞狀態(tài)的細(xì)胞外DNA，健康人和許多疾病患者血清和血漿中都含有一定量的循環(huán)DNA。關(guān)于血漿循環(huán)DNA的來(lái)源目前研究?jī)A向2種觀點(diǎn)：一是細(xì)胞主動(dòng)分泌或釋放產(chǎn)生的DNA片段，這種情況主要發(fā)生在腫瘤細(xì)胞，腫瘤患者血漿循環(huán)DNA水平顯著升高，其來(lái)源大多數(shù)是腫瘤細(xì)胞分泌釋放［4］；二是細(xì)胞死亡后釋放的DNA片段，當(dāng)機(jī)體伴有大量組織細(xì)胞破壞時(shí)，其胞內(nèi)核酸釋放，外周血循環(huán)DNA的含量會(huì)急劇上升。本研究結(jié)果顯示高血壓性腦出血患者血漿循環(huán)DNA水平顯著升高，說(shuō)明高血壓性腦出血后原發(fā)或繼發(fā)的腦組織損傷，導(dǎo)致腦組織細(xì)胞破壞，DNA釋放至血中，致循環(huán)DNA的水平升高，因此循環(huán)DNA可作為反映高血壓性腦出血后腦組織細(xì)胞損傷程度的一項(xiàng)指標(biāo)。

纖維蛋白原是體內(nèi)凝血系統(tǒng)的凝血因子，具有參與炎癥反應(yīng)、血小板活化和血栓形成的病理生理功能，研究發(fā)現(xiàn)血漿纖維蛋白原是腦卒中有力的預(yù)測(cè)因子［5-6］，急性缺血性腦血管病早期血漿纖維蛋白原增高提示預(yù)后不良［7-8］。本研究結(jié)果顯示腦出血患者血漿纖維蛋白原水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），這一結(jié)果也與楊松斌等［9］研究結(jié)果一致。高血壓性腦出血患者血漿纖維蛋白原濃度的升高提示預(yù)后不良，本研究結(jié)果還顯示高血壓性腦出血患者血漿循環(huán)DNA水平與其纖維蛋白原水平呈顯著正相關(guān)，提示檢測(cè)循環(huán)DNA對(duì)判斷高血壓性腦出血病情嚴(yán)重程度和預(yù)后具有重要臨床意義。高血壓性腦出血患者重度組血漿循環(huán)DNA水平顯著高于輕度組和中度組（P＜0.5）；并且中度組顯著高于輕度組（P＜0.5）。雖然腦出血患者重度組血漿纖維蛋白原水平顯著高于輕度組和中度組（P＜0.5），但是中度組與輕度組間血漿纖維蛋白原水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，血漿循環(huán)DNA水平更能準(zhǔn)確、靈敏地反映高血壓性腦出血患者的病情嚴(yán)重程度。

［1］中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)科分會(huì).各類(lèi)腦血管疾病診斷要點(diǎn)［J］.中華神經(jīng)科雜志，1996，29（6）：379.

［2］陳丹，潘世揚(yáng)，張麗霞，等.人血漿DNA雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)法的建立［J］.臨床檢驗(yàn)雜志，2007，25（3）：177-179.

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（本文編輯：劉斯靜）

THE RELATIONSHIP BETWEEN PERIPHERAL BLOOD CIRCULAR DNA AND FIBRINOGEN IN PATIENTSW ITH HYPERTENSIVE INTRACEREBRAL HEMORRHAGE

ZHAO Zhaoxia1，GAO Hong2，XU Yunqiang3，LIU Bei3，WANG Rongxia3，PAN Shiyang4
（1.Department of Laboratory Medicine，the Fifth Hospital of Shijiazhuang，Hebei Province，Shijiazhuang 050021，China；2.Department of Laboratory Medicine，the Fourth Hospital of Shijiazhuang，Hebei Province，Shijiazhuang 050011，China；3.Department of Laboratory Medicine，the Second Hospital of Shijiazhuang，Hebei Province，Shijiazhuang 050051，China；4.Department of Laboratory Medicine，the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Jiangsu Province，Nanjing 210029，China）

Objective To explore the relationship between peripheral blood circular DNA and fibrinogen in patientswith hypertensive intracerebral hemorrhage.M ethods Venous blood of 30 healthy people and 30 patients with hypertensive intracerebral hemorrhage within 24h of illness onset was collected.The level of plasma circular DNA was detected by duplex real-time polymerase chain reaction assay.The level of fibrinogen was detected by blood coagulation analyzer.Results The level of circular DNA in patientswith intracerebral hemorrhage（313.2±224.7）mg/L was significantly higher than that in control group（26.1±5.9）mg/L（P＜0.05）.Patientswith intracerebral hemorrhagewere divided into mild，moderate and severe group.The levels of plasma circular DNA among the three groups were significantly different（P＜0.05）.The level of plasma circular DNA in severe group was significantly

intracranial hemorrahage，hypertensive；fibrinogen；diagnosis

R743.34

A

1007-3205（2013）03-0253-03

2012-04-26；

2012-07-11

石家莊市科學(xué)研究與發(fā)展計(jì)劃課題（101461293）；江蘇省實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室重大課題（XK200731）

趙召霞（1978-），女，山西平陸人，河北省石家莊市第五醫(yī)院醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事分子生物學(xué)研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.03.002

higher than that in mild and moderate group（P＜0.05）；moderate group significantly higher than the mild group（P＜0.05）.The level of fibrinogen in patientswith intracerebral hemorrhage（4.25±1.51）g/L was significantly higher than control group（2.76±0.85）g/L（P＜0.05）.The level of fibrinogen in severe group was significantly higher than that in mild and moderate group（P＜0.05），but the levels of fibrinogen inmoderate group and mild group had no significant difference.Therewas significantly positive correlation between the level of circular DNA and that of fibrinogen（r=0.632，P＜0.05）.Conclusion

Plasma circular DNA can be used as a sensitive parameter of brain cell damage and severity after intracerebral hemorrhage.