李 莉，任廣偉，趙 昱，龔 淼，孟 麗，高福祿

（1.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，河北石家莊050017；2.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院腎內(nèi)科，河北石家莊050031；3.河北師范大學(xué)生命科學(xué)院，河北石家莊050024）

·論 著·

葉黃素對(duì)體外培養(yǎng)的人食管癌Ec-9706細(xì)胞增殖和凋亡的影響

李 莉1，任廣偉2，趙 昱1，龔 淼1，孟 麗1，高福祿3*

（1.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，河北石家莊050017；2.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院腎內(nèi)科，河北石家莊050031；3.河北師范大學(xué)生命科學(xué)院，河北石家莊050024）

目的探討葉黃素對(duì)體外培養(yǎng)的人食管癌9706細(xì)胞（esophageal carcinoma 9706，Ec-9706）增殖和細(xì)胞凋亡的影響。方法將Ec-9706細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMIl640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2/95%空氣飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用隨機(jī)數(shù)字表法，將其隨機(jī)分為4組：對(duì)照組（C組）和不同濃度葉黃素組（L1～3組）。L1～3組分別加入40、80和160μmol/L葉黃素；C組加入等體積RPMI1640培養(yǎng)液。采用噻唑蘭法檢測(cè)不同濃度葉黃素對(duì)人食管癌Ec-9706細(xì)胞增殖的影響；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Ec-9706細(xì)胞凋亡情況；采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)Fas、增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、cyclin D1和Caspase-3蛋白的表達(dá)。結(jié)果葉黃素可抑制Ec-9706細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)Ec-9706細(xì)胞的凋亡，且呈劑量依賴(lài)性。葉黃素可下調(diào)Ec-9706細(xì)胞PCNA和cyclin D1蛋白表達(dá)，上調(diào)Fas和Caspase-3蛋白表達(dá)，且呈劑量依賴(lài)性。結(jié)論葉黃素可抑制體外培養(yǎng)的人食管癌Ec-9706細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，且呈濃度依賴(lài)性，其機(jī)制與下調(diào)PCNA和cyclin D1蛋白表達(dá)，上調(diào)Fas和Caspase-3蛋白表達(dá)有關(guān)。

食管腫瘤；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；葉黃素

葉黃素是廣泛存在于自然界植物中的一種含氧類(lèi)胡蘿卜素。流行病學(xué)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，葉黃素在視覺(jué)保護(hù)、增強(qiáng)免疫功能、預(yù)防慢性病和降低癌癥發(fā)生等方面有廣泛的生物學(xué)活性［1］。有研究［2］表明，葉黃素在抗消化道腫瘤方面有顯著作用，尤其是食管癌。但其機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬探討葉黃素對(duì)體外培養(yǎng)的人食管癌9706細(xì)胞（esophageal carcinoma 9706，Ec-9706）增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器：RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco公司，美國(guó)），胎牛血清（杭州四季青生物制品公司），噻唑蘭和碘化丙啶熒光染料（Sigma公司，美國(guó)），兔抗人 Fas抗體、兔抗人增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗體、兔抗人cyclin D1抗體和兔抗人Caspase-3抗體、SP試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），葉黃素（Sigma公司，美國(guó)），胰蛋白酶（Sigma公司，美國(guó)）；HF-212UV CO2恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司），Motic AE31倒置顯微鏡（Motic公司，德國(guó)），DG5031型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（上海華東電子集團(tuán)醫(yī)療裝備公司），Epics-XLⅡ型流式細(xì)胞儀（Beckman Coulter公司，美國(guó)）。

1.1.2 細(xì)胞株：Ec-9706細(xì)胞株由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所建系，本實(shí)驗(yàn)室凍存。將Ec-9706細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2/95%空氣飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天用0.25%胰酶消化，以1∶2傳代1次。

1.2 方法

1.2.1 葉黃素溶液的配制：實(shí)驗(yàn)前將葉黃素用1mL二甲基亞砜充分溶解，用 RPMI1640培養(yǎng)液配成終濃度為320μmol/L的母液，4℃冰箱避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組：采用隨機(jī)數(shù)字表法，將其隨機(jī)分為4組，即對(duì)照組（C組）和不同濃度葉黃素組（L1～3組）。L1～3組分別加入40、80和160μmol/L葉黃素；C組加入等體積RPMI1640培養(yǎng)液。

1.2.3 葉黃素對(duì)Ec-9706細(xì)胞增殖影響的測(cè)定：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Ec-9706細(xì)胞和正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔滴加200μL單細(xì)胞懸液，使每孔含1.7×103個(gè)細(xì)胞，設(shè)8個(gè)復(fù)孔，同時(shí)接種6個(gè)96孔板，常規(guī)培養(yǎng)24 h。分別在孵育24、48和72h，取出2塊培養(yǎng)板，每孔滴加噻唑蘭溶液（5g/L）20μL，37℃培養(yǎng)箱孵育4 h后終止培養(yǎng)。棄上清，每孔滴加二甲基亞砜200μL，振蕩15 min。酶標(biāo)儀在570 nm處測(cè)定各孔吸光度，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率 =（1-實(shí)驗(yàn)組吸光度值/對(duì)照組吸光度值）×100%。

1.2.4 葉黃素對(duì)Ec-9706細(xì)胞凋亡影響的測(cè)定：取12瓶對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 Ec-9706細(xì)胞，分別于24、48和72h取出不同藥物濃度細(xì)胞4瓶，收集細(xì)胞分別放入4個(gè)15mL離心管內(nèi)標(biāo)記后進(jìn)行離心，制成濃度為7×108個(gè)/L的單細(xì)胞懸液離心后棄上清液緩慢加入預(yù)冷70%無(wú)水乙醇7mL，4℃過(guò)夜。采用碘化丙啶單染法，每份樣品中加入雞紅細(xì)胞作為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)，與樣品同步染色，每份樣品中加入1mL碘化丙啶染液，在4℃避光孵育30min。用488nm氬離子激光器激發(fā)由630nm帶通濾光片接收，通過(guò)散點(diǎn)圖收集10 000個(gè)細(xì)胞，分析碘化丙啶熒光直方圖上凋亡細(xì)胞百分率。

1.2.5 Fas、PCNA、cyclin D1和Caspase-3蛋白表達(dá)的測(cè)定：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制成濃度為1×107個(gè)/L的單細(xì)胞懸液，接種到放有蓋玻片的6孔板，培養(yǎng)箱孵育24h，使細(xì)胞貼壁于蓋玻片上。分別于孵育24、48和72h后取出蓋玻片，SP法進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，3%甲醇-H2O2室溫處理10min，微波抗原修復(fù)（9℃）15min。免疫細(xì)胞化學(xué)染色。用已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。采用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析，每張玻片隨機(jī)取5個(gè)高倍視野，測(cè)定特異性著色的積分光密度值，反映目的蛋白的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，分別采用單因素方差分析和q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 葉黃素對(duì)Ec-9706細(xì)胞增殖的影響：與C組比較，L1～3組細(xì)胞增殖抑制率升高，且呈濃度依賴(lài)性，見(jiàn)表1。

表1 4組Ec-9706細(xì)胞增殖抑制率比較Table 1 Comparison of inhibitory rate of Ec-9706 cells proliferation in 4 groups（n=7，±s，%）

表1 4組Ec-9706細(xì)胞增殖抑制率比較Table 1 Comparison of inhibitory rate of Ec-9706 cells proliferation in 4 groups（n=7，±s，%）

*P＜0.05 vs group C #P＜0.05 vs group L1△P＜0.05 vs group L2by q test

Groups 24h 48h 72h C ---L1 3.0±0.4 27.5±1.9* 48.9±2.2*L2 11.2±0.3*# 41.9±2.7*# 64.7±2.9*#L3 30.3±1.0*#△ 78.2±3.0*#△ 85.7±3.8*#△

2.2 葉黃對(duì)Ec-9706細(xì)胞凋亡的影響：與C組比較，L1～3組細(xì)胞凋亡率升高，且呈濃度依賴(lài)性（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 4組Ec-9706細(xì)胞凋亡率比較Table 2 Comparison of apoptosis rate of Ec-9706 cells in the 4 groups（n=3，±s，%）

表2 4組Ec-9706細(xì)胞凋亡率比較Table 2 Comparison of apoptosis rate of Ec-9706 cells in the 4 groups（n=3，±s，%）

*P＜0.05 vs group C #P＜0.05 vs group L1△P＜0.05 vs group L2by q test

Groups 24h 48h 72h C 1.9±0.6 3.8±1.1 4.0±0.9 L1 8.7±0.9* 14.2±1.3* 42.3±2.1*L2 12.8±1.0* 35.4±2.0*# 63.0±1.3*#L3 28.1±1.2*#△ 67.3±3.3*#△ 75.6±3.0*#△

2.3 葉黃素對(duì)Ec-9706細(xì)胞Fas、Caspase-3、PCNA、cyclin D1蛋白表達(dá)的影響：與C組比較，L1～3組細(xì)胞 PCNA和 cyclin D1蛋白表達(dá)下調(diào)，F(xiàn)as和Caspase-3蛋白表達(dá)上調(diào)，且呈濃度依賴(lài)性（P＜0.05），見(jiàn)表3～6。

表3 4組Ec-9706細(xì)胞PCNA蛋白表達(dá)比較Table 3 Comparison of PCNA protein expression of Ec-9706 cells in the 4 groups（n=5，±s，OD）

表3 4組Ec-9706細(xì)胞PCNA蛋白表達(dá)比較Table 3 Comparison of PCNA protein expression of Ec-9706 cells in the 4 groups（n=5，±s，OD）

*P＜0.05 vs group C #P＜0.05 vs group L1△P＜0.05 vs group L2by q test

Groups 24h 48h 72h C 90.5±2.3 91.9±1.6 91.4±2.1 L1 86.2±1.7 80.5±1.0* 77.3±1.4*L2 80.3±1.2 72.3±1.8*# 69.4±1.7*#L3 69.7±1.1*#△ 65.0±1.2*#△ 59.8±1.9*#△

表4 4組Ec-9706細(xì)胞cyclin D1蛋白表達(dá)比較Table 4 Comparison of cyclin D1 protein expression of Ec-9706 cells in the 4 groups（n=5，±s，OD）

表4 4組Ec-9706細(xì)胞cyclin D1蛋白表達(dá)比較Table 4 Comparison of cyclin D1 protein expression of Ec-9706 cells in the 4 groups（n=5，±s，OD）

*P＜0.05 vs group C #P＜0.05 vs group L1△P＜0.05 vs group L2by q test

Groups 24h 48h 72h C 89.0±2.1 88.9±1.1 90.7±2.5 L1 87.2±1.7 82.6±1.4* 78.0±1.4*L2 80.5±1.7 75.1±1.5*# 69.2±1.3*#L3 70.9±1.3*#△ 64.7±1.2*#△ 59.6±1.1*#△

表5 4組Ec-9706細(xì)胞Fas蛋白表達(dá)比較Table 5 Com parison of Fas protein expression of Ec-9706 cells in the 4 groups（n=5，±s，OD）

表5 4組Ec-9706細(xì)胞Fas蛋白表達(dá)比較Table 5 Com parison of Fas protein expression of Ec-9706 cells in the 4 groups（n=5，±s，OD）

*P＜0.05 vs group C #P＜0.05 vs group L1△P＜0.05 vs group L2by q test

Groups 24h 48h 72h C 5.6±2.4 7.3±3.0 10.0±2.5 L1 18.6±2.3* 26.9±3.4* 39.2±2.9*L2 30.1±3.5*# 42.5±2.6*# 51.3±3.2*#L3 49.7±3.9*#△ 60.1±4.1*#△ 70.8±3.4*#△

表6 4組Ec-9706細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)比較Table 6 Com parison of Caspase-3 protein expression of Ec-9706 cells in the 4 groups（n=5，±s，OD）

表6 4組Ec-9706細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)比較Table 6 Com parison of Caspase-3 protein expression of Ec-9706 cells in the 4 groups（n=5，±s，OD）

*P＜0.05 vs group C #P＜0.05 vs group L1△P＜0.05 vs group L2by q test

Groups 24h 48h 72h 0 6.1±2.0 7.4±1.3 9.3±2.1 L1 18.9±2.7* 29.2±2.8* 43.1±2.3*L2 32.5±3.5*# 44.1±3.0*# 55.0±2.9*#L3 52.6±3.6*#△ 62.4±3.1*#△ 74.3±4.0*#△

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)研究了葉黃素對(duì)低分化人食管癌Ec-9706細(xì)胞株的增值抑制和凋亡誘導(dǎo)作用。腫瘤細(xì)胞區(qū)別于正常細(xì)胞的一個(gè)重要特征就是腫瘤細(xì)胞可以持續(xù)分裂并不斷增殖［3］。本研究結(jié)果顯示，葉黃素對(duì)Ec-9706細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用，并呈濃度依賴(lài)性，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)160μmol/L濃度葉黃素組對(duì) Ec-9706細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用大于40μmol/L濃度組，葉黃素溶液在160μmol/L濃度下作用72h對(duì)細(xì)胞的抑制增殖作用最明顯。

PCNA又稱(chēng)周期蛋白，是DNA聚合酶8的輔助成分，與細(xì)胞的DNA復(fù)制有關(guān)［4］，與細(xì)胞周期的不同時(shí)相密切相關(guān)［5］。PCNA的陽(yáng)性表達(dá)程度直接反映DNA復(fù)制的程度，可作為評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖狀態(tài)的重要指標(biāo)［6］。本研究結(jié)果顯示，在 Ec-9706細(xì)胞中PCNA陽(yáng)性表達(dá)的平均光密度值為90.5±2.3，隨著葉黃素濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，PCNA在Ec-9706細(xì)胞中的陽(yáng)性表達(dá)率逐漸降低，160μmol/L葉黃素溶液作用72h后細(xì)胞中PCNA的陽(yáng)性表達(dá)率平均光密度值僅為59.8±1.9。說(shuō)明葉黃素可以抑制Ec-9706細(xì)胞的增殖。

cyclin D1是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的主要蛋白之一，其在細(xì)胞由G0期進(jìn)入G1期的過(guò)程中起重要作用。若cyclin D1受抑制，則細(xì)胞不能進(jìn)入S期，增殖受到抑制［7］。本研究結(jié)果顯示，在Ec-9706細(xì)胞中cyclin

D1陽(yáng)性表達(dá)的平均光密度值為89.0±2.1，隨著葉黃素濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，cyclin D1在Ec-9706細(xì)胞中的陽(yáng)性表達(dá)率逐漸降低，160μmol/L葉黃素溶液作用72h后細(xì)胞中cyclin D1的陽(yáng)性表達(dá)率平均光密度值僅為59.6±1.1。此結(jié)果與流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡情況結(jié)果一致。說(shuō)明葉黃素可以通過(guò)下調(diào)cyclin D1的表達(dá)抑制Ec-9706細(xì)胞的增殖，促進(jìn)凋亡。

Fas屬于神經(jīng)生長(zhǎng)因子/腫瘤壞死因子受體超家族成員，是一種促進(jìn)凋亡的相關(guān)基因［8］。Fas途徑是T細(xì)胞消滅腫瘤細(xì)胞的重要途徑。腫瘤細(xì)胞下調(diào)Fas的表達(dá)水平使免疫逃避發(fā)生［9］。本研究結(jié)果顯示，隨著葉黃素濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，F(xiàn)as在 Ec-9706細(xì)胞中的陽(yáng)性表達(dá)率逐漸增高，160μmol/L葉黃素溶液作用72h后Fas在細(xì)胞中的陽(yáng)性表達(dá)平均光密度值增高至70.8±3.4。提示葉黃素有可能作用于細(xì)胞中的Fas蛋白，使Fas信號(hào)傳導(dǎo)體系誘導(dǎo)激活細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡途徑相關(guān)因子。說(shuō)明葉黃素可以通過(guò)此途徑誘導(dǎo)Ec-9706細(xì)胞的凋亡。

Caspase-3是天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶家族中最重要的一員，是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵效應(yīng)分子。其活化可以導(dǎo)致級(jí)聯(lián)反應(yīng)活化，直接激活DNA斷裂因子和核酸內(nèi)切酶，降解細(xì)胞骨架蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［10］。本研究結(jié)果顯示，隨著葉黃素濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，Caspase-3在Ec-9706細(xì)胞中的陽(yáng)性表達(dá)率逐漸增高，160μmol/L葉黃素溶液作用72h后Caspase-3在細(xì)胞中的陽(yáng)性表達(dá)平均光密度值增高至74.3±4.0。與Fas表達(dá)水平結(jié)果一致。提示葉黃素可以通過(guò)此凋亡共同途徑誘導(dǎo)Ec-9706細(xì)胞的凋亡。

腫瘤的生物學(xué)共性是失控性生長(zhǎng)，主要機(jī)制是細(xì)胞周期紊亂導(dǎo)致增殖過(guò)多和凋亡過(guò)少。細(xì)胞凋亡是指由體內(nèi)外因素觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡過(guò)程［11］。凋亡細(xì)胞的DNA分子發(fā)生斷裂，相對(duì)分子質(zhì)量小的DNA片段丟失，相對(duì)分子質(zhì)量大的片段形成一個(gè)DNA含量小于二倍體的區(qū)域，在流式細(xì)胞儀檢測(cè)中形成位于G0/G1峰之前的亞G1峰，壞死的細(xì)胞檢測(cè)不出現(xiàn)此峰，故此峰被稱(chēng)作凋亡峰，凋亡峰的高度和寬度與凋亡細(xì)胞的數(shù)量成正比［12］。本研究結(jié)果顯示，隨著葉黃素作用濃度的增高和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，亞G1峰的高度和寬度隨之增加。說(shuō)明葉黃素可以誘導(dǎo)Ec-9706細(xì)胞凋亡，并有濃度依賴(lài)關(guān)系。此結(jié)果與前面噻唑蘭和流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力和細(xì)胞周期相一致。

綜上所述，葉黃素可抑制體外培養(yǎng)的人食管癌Ec-9706細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，且呈濃度依賴(lài)性，其可能機(jī)制與抑制cyclin D1和PCNA的表達(dá)，同時(shí)活化Fas和Caspase-3有關(guān)。

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（本文編輯：趙麗潔）

EFFECTSOF LUTEIN ON THE PROLIFERATION AND APOPTOSIS OF HUMAN ESOPHAGEAL CARCINOMA EC-9706 CELLS IN VITRO

LILi1，REN Guangwei2，ZHAO Yu1，GONG Miao1，MENG Li1，GAO Fulu3*
（1.Department of Histology and Embryology，the School of Basic Medical Sciences，HebeiMedical University，Shijiazhuang 050017，China；2.Department of Nephrology，the First Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050031，China；3.School of Life Sciences，Hebei Normal University，Shijiazhuang 050024，China）

Objective To observe the effects of lutein on the proliferation and apoptosis of human esophageal carcinoma 9706（Ec-9706）cell line in vitro.M ethods The inhibitory effect of lutein on the proliferation of human Ec-9706 cells at different concentrations was determined by methyl thiazolyltetrazolium（MTT）assay.The changes of cell apoptosis rate of tumor cells were determined by flow cytometry（FCM）.The expression of Fas，proliferating cell nuclear antigen（PCNA），cyclin D1 and Caspase-3 proteins were examined by immunocytochemical technique.Results Lutein significantly inhibited the proliferation and induced the apoptosis of Ec-9706 cells in a dose-dependentmanner.Lutein dramatically inhibited protein expression of PCNA and cyclin D1，while up-regulated the expression of Fas and Caspase-3 protein.Conclusion Lutein can inhibit the proliferation of Ec-9706 cells and induce the apoptosis of Ec-9706 cells in vitro by down-regulating the expression of PCNA and cyclin D1 and up-

esophageal neoplasms；cell proliferation；apoptosis；lutein

R735.1

A

1007-3205（2013）03-0249-04

2012-12-11；

2013-02-26

河北省科技廳計(jì)劃指導(dǎo)課題（10276181）

李莉（1976-），女，河北石家莊人，河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院講師，醫(yī)學(xué)碩士，從事組織胚胎學(xué)研究。

*通訊作者

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.03.001

regulating Fas and Caspase-3 expression.