姚麗，曾千春，楊昆，趙培方，吳才文

（1.云南省甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所,開遠(yuǎn)661600；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院,昆明650201）

2，4-D、NAA對甘蔗胚性愈傷組織形成及分化的影響

姚麗1，曾千春2，楊昆1，趙培方1，吳才文1

（1.云南省甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所,開遠(yuǎn)661600；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院,昆明650201）

以新臺糖22（ROC22）、福農(nóng)94-0403、云蔗03-258及P44為材料，MS為基本培養(yǎng)基，研究切割厚薄不同的外植體及2，4-D濃度對甘蔗愈傷組織誘導(dǎo)的影響，R1、R2及R3三種不同培養(yǎng)基對分化不定芽的影響。結(jié)果表明：①外植體切片0.1cm時(shí)的誘導(dǎo)率較切段0.5cm高；②切片時(shí)最適2，4-D濃度為1～2mg/L，而切段時(shí)則以3mg/L時(shí)誘導(dǎo)率達(dá)最大；③R2和R3分化效果優(yōu)于R1，R3分化培養(yǎng)基：MS+6-BA 1mg/L+NAA 1mg/L對愈傷組織分化不定芽的效果最佳。

甘蔗；組織培養(yǎng)；2，4-D；NAA

甘蔗（Saccharum spp.）是重要的糖料和能源作物。蔗糖約占世界食糖總產(chǎn)量的70%～80%,而在我國達(dá)90%以上[1]。甘蔗是無性繁殖作物,用種量大、繁殖倍數(shù)低,通過組織培養(yǎng)快繁技術(shù)能加快品種繁殖及推廣速度。甘蔗也是第一個(gè)獲得組織培養(yǎng)成功的禾本科植物,自1969年Babar和Nickell在斐濟(jì)突破從甘蔗組織培養(yǎng)物中實(shí)現(xiàn)植株再生距今已有四十多年[2],甘蔗組織培養(yǎng)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于健康種苗快繁及甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化領(lǐng)域[3-6]。但是,對于遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜的甘蔗而言,甘蔗愈傷組織的誘導(dǎo)、增殖和分化能力等組織培養(yǎng)特性受遺傳調(diào)控,不同基因型再生效率存在較大差異[7-9]。而甘蔗胚性愈傷組織是良種快繁及遺傳轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵及基礎(chǔ)。因此,獲得高質(zhì)量的胚性愈傷組織,并使之大量分化成芽對健康種苗快繁及甘蔗基因工程育種具有深遠(yuǎn)意義。但是,大量甘蔗組織培養(yǎng)需要大量甘蔗莖梢之間的矛盾日益嚴(yán)重。傳統(tǒng)大部分研究者把外植體切成0.25～0.5cm長的段來誘導(dǎo)[7-11],但是該法較浪費(fèi)材料,也有把外植體切成0.1cm厚的小圓片來誘導(dǎo)[3,12-13]。但是這兩種外植體類型所需的2,4-D濃度是否存在差異,它們之間有什么相關(guān)性未見報(bào)道。

筆者選用大面積種植的生產(chǎn)品種及潛力甘蔗品種作為研究材料,比較切割厚薄不同的外植體及不同2,4-D濃度對甘蔗愈傷組織誘導(dǎo)的影響,并添加不同濃度的6-BA、KT及NAA,比較不同激素組合對分化不定芽的影響,為今后甘蔗健康種苗快繁及遺傳轉(zhuǎn)化研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1植物材料

以新臺糖22（ROC22）、福農(nóng)94-0403、P44及云蔗03-258為研究材料。其中,ROC22為全國主栽品種, P44、福農(nóng)94-0403及云蔗03-258為糖能兼用品種。

1.2方法

1.2.1 愈傷組織誘導(dǎo)取ROC22、P44、福農(nóng)94-0403及云蔗03-258甘蔗幼嫩葉鞘未成熟心葉為外植體, 75%酒精擦拭表面切取片（0.1cm）、段（0.5cm）兩種類型,接種到MS培養(yǎng)基,25℃暗培養(yǎng),誘導(dǎo)胚性愈傷組織產(chǎn)生。誘導(dǎo)愈傷時(shí)2,4-D濃度設(shè)1、2、3、4mg/L 4個(gè)梯度,每處理30個(gè)切段或切片,每處理3次重復(fù)。誘導(dǎo)率（%）=出愈傷組織總塊數(shù)/接入外植體總塊數(shù)×100。

1.2.2 分化培養(yǎng)基比較以ROC22、94-0403為材料,比較R1、R2及R3三種分化培養(yǎng)基,R1：MS+6-BA 2mg/L+KT 1.5mg/L；R2：MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.1mg/L；R3：MS+6-BA 1mg/L+NAA 1mg/L。蔗糖：30 g/L,瓊脂：7 g/L；pH=5.8。每處理30塊愈傷組織,3次重復(fù),培養(yǎng)30d后觀察統(tǒng)計(jì),比較R1、R2及R3三種分化培養(yǎng)基分化芽數(shù)及生長情況。分化率（%）=分化出芽總塊數(shù)/接入愈傷組織總塊數(shù)×100。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理運(yùn)用SPSS13.0專業(yè)版分析軟件進(jìn)行方差分析,新復(fù)極差多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1影響愈傷組織誘導(dǎo)率的因素

愈傷組織誘導(dǎo)效果受切片與切段的影響,且品種間出現(xiàn)明顯差異。厚薄不同的外植體類型及2,4-D濃度對甘蔗愈傷組織誘導(dǎo)率的影響,結(jié)果詳見表1。

由表1可以看出,切片時(shí)ROC22、P44在2,4-D質(zhì)量濃度為1mg/L時(shí)誘導(dǎo)率達(dá)最大值,分別是100%、92.86%,福農(nóng)94-0403、云蔗03-258則在2,4-D濃度為2mg/L時(shí)誘導(dǎo)率達(dá)最大值,分別是100%、72.22%；而切段時(shí),除福農(nóng)94-0403在2,4-D質(zhì)量濃度為2mg/L時(shí)誘導(dǎo)率達(dá)最大值外,ROC22、P44及云蔗03-258都在2,4-D濃度為3mg/L時(shí)誘導(dǎo)率達(dá)最大值,分別是90.91%、88.24%及76.00%。因此,切片時(shí)2,4-D的最佳濃度為1～2mg/L,而切段時(shí)最佳濃度則是3mg/L。

不同品種間誘導(dǎo)率有差異,平均誘導(dǎo)率由大到小的順序是：福農(nóng)94-0403＞P44＞ROC22＞云蔗03-258。除云蔗03-258外,切片時(shí)誘導(dǎo)率平均值皆在80%以上,而切段時(shí)誘導(dǎo)率平均值僅在70%左右。且經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn),切片時(shí)從第3d開始陸續(xù)在切口處出現(xiàn)細(xì)胞膨大體,而切段則要10d左右。因此,切片誘導(dǎo)較切段誘導(dǎo)更易在較短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)胚性愈傷組織。總之,外植體切片誘導(dǎo)效果更好,2,4-D的最佳濃度為1～2mg/L。

2.2分化培養(yǎng)基的比較

愈傷組織分化效果受培養(yǎng)基和品種的影響,分化結(jié)果表現(xiàn)出明顯的差異。以ROC22、福農(nóng)94-0403為材料,在R1、R2及R3三種分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)30d后觀察統(tǒng)計(jì),計(jì)算分化率,結(jié)果詳見表2。

由表2可看出,校正模型（Corrected Model）是“品種”、“培養(yǎng)基”及“品種×培養(yǎng)基”對應(yīng)值之和,F= 42.465,P=0.000＜0.01,差異極顯著,表明所用模型有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。品種的F=136.743,P=0.000＜0.01,差異極顯著；培養(yǎng)基的F=32.323,P=0.000＜0.01,差異極顯著；品種與培養(yǎng)基互作的F=5.469,P=0.021＜0.01,差異顯著。這說明不同品種和不同培養(yǎng)基對甘蔗的分化率均有極顯著影響,且影響次序?yàn)槠贩N＞培養(yǎng)基＞品種與培養(yǎng)基的互作。

由表3多重比較分析可知,愈傷組織在3種培養(yǎng)基中均能分化不定芽,但不同品種分化芽數(shù)差異較大。對于ROC22而言,培養(yǎng)基對分化率的影響依次是R3＞R1＞R2,但差異不顯著；而對于福農(nóng)94-0403,培養(yǎng)基對分化率的影響依次是R3＞R2＞R1,且差異極顯著。2個(gè)甘蔗品種均以添加NAA的R3分化效果最好,添加KT的R1效果較差,尤以褐化嚴(yán)重的品種福農(nóng)94-0403最為明顯（圖1）。說明6-BA+KT組合褐變較6-BA+NAA組合嚴(yán)重。此外,在相同激素組合與相同濃度下,ROC22的分化率均高于福農(nóng)94-0403,說明分化率受品種遺傳特性影響。總之,R3培養(yǎng)基為試驗(yàn)品種的最佳分化培養(yǎng)基。

表1 不同2,4-D濃度誘導(dǎo)率（%）的比較

表2 不同甘蔗品種、分化培養(yǎng)基對分化率的方差分析

表3 不同甘蔗品種、分化培養(yǎng)基的分化率(%)

圖1 不同分化培養(yǎng)基的比較

3 討論

3.1外植體類型及2，4-D濃度是影響甘蔗愈傷組織誘導(dǎo)率的重要因素

2,4-D是誘導(dǎo)甘蔗愈傷組織不可缺少的生長物質(zhì)[14-16]。本研究比較了切割厚薄不同的兩種外植體的誘導(dǎo)率,筆者發(fā)現(xiàn),2,4-D使用濃度不僅因不同基因型而存在差異,而且外植體的厚薄也能影響誘導(dǎo)率,且外植體厚薄不同、使用的2,4-D濃度也隨之不同。研究結(jié)果表明,外植體切成0.1cm厚的小圓片時(shí),2,4-D濃度為1～2mg/L時(shí)誘導(dǎo)率達(dá)最大值,而切段則在3 mg/L時(shí)誘導(dǎo)率達(dá)最大。這可能是因?yàn)樵谙嗤笮〉闹睆较?外植體切成0.1cm的片比切成0.5cm的段更接近培養(yǎng)基、體積更小、消耗更少,因此需要的2,4-D也較少。另外,筆者還發(fā)現(xiàn),用0.1cm厚的小圓片不僅節(jié)約了材料及成本,而且誘導(dǎo)時(shí)間也較短、質(zhì)量也較好。因此,供試品種以外植體切片、2,4-D濃度為1～2mg/L誘導(dǎo)愈傷組織效果最好。

3.2 NAA對甘蔗愈傷組織分化出苗的影響

不同激素混合使用更有利于降低分化苗的變異率[17]。曾東火等[10]認(rèn)為細(xì)胞分裂素（KT、6-BA）與生長素（NAA、IBA）混合使用分化率高、苗多,而細(xì)胞分裂素則KT優(yōu)于6-BA。但何明等（1988）[18]報(bào)道KT對于甘蔗幾乎沒有什么效果。而生長素則以NAA較好,因?yàn)镹AA不僅有促進(jìn)生根的作用,對于禾本科及某些單子葉植物而言,也有利于分化的作用[19]。賢武等（2000）[20]研究也表明,6-BA+KT組合褐變最嚴(yán)重,最輕的是6-BA和6-BA+NAA,且濃度越低褐變越輕。本研究試驗(yàn)也表明,6-BA+KT組合的R1褐變最嚴(yán)重,6-BA+NAA組合的R2次之、R3最輕,特別是褐化較嚴(yán)重的福農(nóng)94-0403更明顯。這可能是因?yàn)榧?xì)胞分裂素類物質(zhì)有刺激和增進(jìn)甘蔗多酚氧化酶活性的作用,因而增加“酚-醌”類物質(zhì)對細(xì)胞的毒害,這就解釋了為什么含細(xì)胞分裂素相對較多的分化培養(yǎng)基褐化最嚴(yán)重,分化效果最差。研究結(jié)果表明：R3分化培養(yǎng)基對供試品種愈傷組織分化不定芽的效果最佳。

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Effects of 2,4-D and NAA on Embryogenic Callus Formation and Shoot Regeneration of Sugercane（Saccharum spp.）

YAO Li1,ZENG Qian-chun2,YANG Kun1,ZHAO Pei-fang1,WU Cai-wen1
（1.Yunnan Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement/Sugarcane Research Institute,Yunnan Academy of Agricultural Sciences,Kaiyuan 661600,China;2.College of Agronomy and Biotechnology,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201, China）

Explants of sugarcane varieties ROC22,Funong 94-0403,Yunzhe 03-358 and P44 were cultured on MS medium with various supplements.Experiments were executed to evaluate the effect of different thickness of explants and different concentration of 2,4-D on callus induction as well as three different medium of R1,R2, R3 on shoot regeneration.The results were as the following:firstly,the induction rate of explants of 0.1 cm thick discs was higher than that of 0.5 cm thick segments;secondly,the appropriate 2,4-D concentration for callus induction were 1-2 mg/L for explants of 0.1 cm thick and 3 mg/L for explants of 0.5 cm thick;thirdly,shoot regeneration rating ofthe R2 and R3 were better than thatofthe R1,and the R3 medium:MS supplemented with NAA at 1 mg/L and 6-BA at1 mg/L was the bestmedium for shootregeneration.

sugarcane;tissue culture;explantthickness;2,4-D;NAA

S566.1；Q78

：A

1007-2624（2013）02-0008-03

2013-01-27

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金（CARS-20-1-1）。

姚麗（1984-）,女,云南省金平縣人,碩士,研究實(shí)習(xí)員,主要從事甘蔗遺傳育種研究。

吳才文,研究員,主要從事甘蔗遺傳育種研究。E-mail：gksky_wcw@163.com