鐘 磊，王林紅，喬亞科，崔姍姍，紀展波，李桂蘭

(河北科技師范學院生命科技學院，河北秦皇島，066600)

大豆是公認的較難進行遺傳轉化的植物之一。農(nóng)桿菌介導的大豆遺傳轉化是最早被開發(fā)出來并且是目前應用最廣泛的一種轉基因技術［1］，該法具有操作簡單，費用低廉，可插入基因片段大，不容易發(fā)生重排等優(yōu)點。農(nóng)桿菌轉化所用的外植體主要有子葉節(jié)［2～6］、無菌苗的莖尖［7］、未成熟胚子葉［8］、上胚軸和初生葉［9］、子葉［10］、成熟胚的胚尖［11］、未成熟胚體細胞胚［12］等，而對利用未成熟大豆種子子葉節(jié)的轉化研究報道則較少。筆者以不同大豆品種的未成熟種子子葉節(jié)為轉化受體，研究其遺傳轉化影響因素，為提高大豆遺傳轉化效率提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試大豆品種:冀豆7號，豫豆22，九農(nóng)26，鄭97196，品系10，品系12。

植物表達載體:pX6PTF1(河北農(nóng)業(yè)大學張彩英研究員提供)［13］。

1.2 方法

1.2.1 外植體的制備 選取開花后不同發(fā)育時期的大豆豆莢，清水沖洗表面，體積分數(shù)為0.75的酒精消毒1 min，無菌水沖洗1次，質(zhì)量濃度為1.0 g/L的氯化汞溶液消毒10 min，無菌水沖洗3次。無菌條件下取出未成熟種子，滅菌的液體共培養(yǎng)基(或無菌蒸餾水)浸泡15 min，去掉種皮，將2片子葉從胚軸縱切，去除幼芽和胚尖。

1.2.2 菌液制備 挑取工程菌的單菌落，接種到鏈霉素、壯觀霉素質(zhì)量濃度為50 mg/L的LB液體培養(yǎng)基中，180 r/min，28 ℃振蕩培養(yǎng) 2～3 d至OD600=0.6～0.8。隨后吸取OD600=0.6～0.8 菌液，接種到新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)至OD600=0.3～0.5。將菌液5 000 r/min，4℃離心10 min，棄上清，沉淀重懸于與共培養(yǎng)基成分相同的液體培養(yǎng)基中，調(diào)整菌液濃度至OD600=0.3～0.5，備用。

1.2.3 共培養(yǎng) 將制備好的農(nóng)桿菌菌液侵染外植體30 min，接種到共培養(yǎng)基，24℃恒溫培養(yǎng)4 d。

1.2.4 抗性植株再生 共培養(yǎng)后經(jīng)抗性芽誘導、伸長、生根、移栽和馴化后獲得抗性植株。

1.3 試驗設計

1.3.1 子葉節(jié)預處理試驗 以冀豆7為材料，對所取材料分別進行如下預處理:處理1，對去除莢皮的種子在4℃下處理24 h，切制子葉節(jié);處理2，將豆莢在4℃低溫處理24 h，然后消毒后除去豆莢皮切制子葉節(jié);處理3，取新鮮豆莢直接去莢皮后切制子葉節(jié)。

1.3.2 共培養(yǎng)溫度試驗 以開花60 d的冀豆7未成熟種子為材料，共培養(yǎng)溫度設置3個處理:22，24，26℃。

1.3.3 共培養(yǎng)光照試驗 以開花60 d的冀豆7未成熟子葉節(jié)為外植體，共培養(yǎng)時設置3個光照長度處理:0，16，24 h/d。

1.3.4 不同品種試驗 以豫豆22，冀豆7號，鄭97196，九農(nóng)26，品系10和品系12為受體品種，取開花60 d的未成熟種子制備子葉節(jié)外植體。

每個單因素試驗中每個處理切制外植體50個，3次重復。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)應用DPSv 7.05版統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 種子成熟度對大豆未成熟子葉節(jié)轉化抗性芽誘導的影響

以冀豆7號為材料，分析開花后50，60，67 d未成熟種子子葉節(jié)外植體的芽誘導率發(fā)現(xiàn)，以開花后60 d，種子達到最飽滿程度所制備的外植體抗性芽誘導率和平均抗性芽數(shù)最高，與開花后50 d的和開花后67 d的差異均達到極顯著(表1);而開花后50 d的未成熟子葉節(jié)經(jīng)誘導后易產(chǎn)生愈傷組織，抗性芽數(shù)量較少;開花后67 d的種子由于已經(jīng)開始縮水變小，故抗性芽率和平均抗性芽數(shù)出現(xiàn)下降現(xiàn)象。

表1 大豆未成熟種子發(fā)育程度對遺傳轉化的影響

2.2 外植體低溫預處理對大豆未成熟子葉節(jié)轉化抗性芽誘導的影響

分析3種外植體預處理方法對抗性芽誘導率的影響發(fā)現(xiàn)，以不經(jīng)過預處理的新鮮材料抗性芽誘導率最高，達到55.9%，與其他2個處理差異顯著(p＜0.01);而經(jīng)過4℃低溫預處理24 h的抗性芽誘導率較低，二者差異不顯著(p＞0.05)。說明24 h的4℃低溫處理對未成熟種子的子葉節(jié)遺傳轉化不利(圖1)。

2.3 共培養(yǎng)溫度對大豆未成熟子葉節(jié)轉化抗性芽誘導的影響

分析不同共培養(yǎng)溫度條件下的抗性芽誘導率發(fā)現(xiàn)，在一定溫度范圍內(nèi)，隨共培養(yǎng)溫度的上升，未成熟子葉節(jié)的平均出芽數(shù)呈現(xiàn)上升趨勢，在3個處理溫度中，以26℃條件下的未成熟胚的平均抗性芽個數(shù)最高(圖2)。但是3個溫度處理之間差異不顯著。

圖1 不同預處理對大豆未成熟種子遺傳轉化的影響

圖2 共培養(yǎng)溫度對大豆未成熟子葉節(jié)出芽的影響

2.4 共培養(yǎng)階段光照對大豆未成熟子葉節(jié)轉化抗性芽誘導的影響

分析不同光照時間對大豆子葉節(jié)轉化抗性芽誘導的影響表明，在共培養(yǎng)階段提供一定時間的光照對大豆未成熟子葉節(jié)轉化有促進作用(表2)。光照處理的大豆子葉節(jié)共培養(yǎng)后顏色變成深綠色，其抗性芽出芽率和平均出芽數(shù)都有所提高。提供光照24 h/d的處理，子葉節(jié)抗性芽誘導率最高，為56.64%，平均出芽數(shù)也達到2.27個，并與其他2個處理差異顯著。

表2 共培養(yǎng)階段光照時間對大豆未成熟子葉節(jié)遺傳轉化的影響

2.5 大豆基因型對未成熟子葉轉化抗性芽誘導的影響

分析不同品種抗性芽誘導率發(fā)現(xiàn)，以冀豆7號，豫豆22和品系12的每個外植體的平均抗性芽數(shù)較高，達到2.11～2.18，3個品種之間差異不顯著;冀豆7號，豫豆22和品系12均與九農(nóng)26，鄭97196，品系10之間差異達到顯著水平(p＜0.05)(圖3)。九農(nóng)26不僅出芽率低，而且易出現(xiàn)畸形芽，成苗率最低。

圖3 不同大豆品種未成熟種子子葉節(jié)遺傳轉化比較

3 結論與討論

在遺傳轉化過程中抗性芽形成是獲得轉基因苗的前提。王盧平等［14］研究表明，當豆莢及種子發(fā)育到最大、鼓粒飽滿、種皮變黃時，未成熟種子子葉節(jié)不定芽誘導率最高。本研究在農(nóng)桿菌介導的轉化體系中也得到一致的結果，以豆莢和種子體積發(fā)育到最大(開花后60～66 d)，豆莢開始由綠色變黃時，未成熟子葉節(jié)的抗性芽率和平均抗性芽值都達到最高。

轉化過程中共培養(yǎng)階段的外部環(huán)境條件直接影響著農(nóng)桿菌的侵染及T-DNA的轉移，同時也影響著受體細胞的感受狀態(tài)。本研究表明，從大豆植株上取的新鮮豆莢直接制備外植體，不經(jīng)過預處理，產(chǎn)生的抗性芽數(shù)最多;轉化過程中，在26℃，24 h/d光照共培養(yǎng)條件下獲得較高的抗性芽產(chǎn)生率。已有研究表明，在大豆成熟種子的子葉節(jié)轉化系統(tǒng)中，不同大豆基因型對農(nóng)桿菌的敏感性存在著差異［15］。在本研究中，未成熟大豆子葉節(jié)轉化也存在著基因型差異，冀豆7，豫豆22和品系12的未成熟子葉抗性芽率較高。

大豆未成熟種子子葉節(jié)作為遺傳轉化外植體，具有取材方便、簡化遺傳轉化外植體制備過程的優(yōu)點，本研究僅就部分影響因素進行了初步探討，建立一個完善的大豆未成熟子葉節(jié)轉化體系尚需進行深入研究。

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(責任編輯:朱寶昌)