趙佳明，高 璐，田 英，何國(guó)金，陳勁宏，金海威

(1.大連市口腔醫(yī)院 種植科，遼寧 大連116021;2.大連醫(yī)科大學(xué) 口腔醫(yī)學(xué)院，遼寧 大連116044)

臨床統(tǒng)計(jì)學(xué)調(diào)查顯示，口腔臨床的治療過程，如局部麻醉、種植牙手術(shù)、牙齒拔出及牙髓治療等操作常常不可避免的導(dǎo)致不同程度的下牙槽神經(jīng)損傷，發(fā)生率可達(dá)20% ～35%［1-2］。下牙槽神經(jīng)是三叉神經(jīng)下頜神經(jīng)的分支，主要分布于下頜牙齒、牙齦、頦部和下唇的皮膚和黏膜，傳導(dǎo)這些部位的痛覺、觸壓覺及本體感覺。研究表明，下牙槽神經(jīng)損傷不僅引起劇烈疼痛、異常麻木等多種口頜面功能障礙，并且可以誘發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病，影響記憶及學(xué)習(xí)能力等［3］。因此，積極探索下牙槽神經(jīng)損傷后再生治療的有效途徑，具有重要意義。

近年來研究表明，多種神經(jīng)病理性疾病的損傷因素都與線粒體緊密相關(guān)。事實(shí)上，由于線粒體在多種神經(jīng)損傷中的核心地位，它正作為新的藥物作用靶點(diǎn)而引起人們的高度重視［4］。動(dòng)物模型研究提示，線粒體能量代謝的異常是神經(jīng)元及其軸突受損的早期事件［5］。應(yīng)用鹽酸乙酰左卡尼汀早期改善線粒體功能，可以有效逆轉(zhuǎn)神經(jīng)損傷導(dǎo)致的神經(jīng)退行性變性，從而有效緩解動(dòng)物的疼痛癥狀［6］。

線粒體作為真核細(xì)胞生成ATP 的重要細(xì)胞器，對(duì)細(xì)胞的正常生命活動(dòng)發(fā)揮著重要作用，不僅線粒體的功能障礙如膜電位、呼吸鏈、蛋白定位、細(xì)胞色素C、氧自由基等的異?？梢鸶鞣N疾病的發(fā)生，其結(jié)構(gòu)的異常也可以直接或間接的影響整個(gè)細(xì)胞的正常功能、導(dǎo)致病變。許多研究表明，帕金森氏癥、阿爾茲海默病、糖尿病等神經(jīng)退行性病變的發(fā)生發(fā)展均與線粒體結(jié)構(gòu)及功能的異常有關(guān)［7］。

本研究模擬臨床下牙槽神經(jīng)損傷特點(diǎn)，建立大鼠下牙槽神經(jīng)壓榨損傷動(dòng)物模型，應(yīng)用透射電鏡觀察半月神經(jīng)節(jié)(trigeminal ganglion，TG)神經(jīng)元及其軸突線粒體的超微結(jié)構(gòu)的改變，探討線粒體參與外周神經(jīng)損傷及修復(fù)機(jī)制的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，為下牙槽神經(jīng)損傷的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

選取健康Sprague-Dawley 雄性大鼠10 只，隨機(jī)分為空白對(duì)照組2 只，實(shí)驗(yàn)組8 只。

1.2 動(dòng)物模型建立

腹腔注射苯巴比妥鈉及氨基甲酸乙酯麻醉動(dòng)物，經(jīng)咬肌表面皮膚做切口，分離肌肉顯露單側(cè)下頜骨，去除下頜神經(jīng)管外側(cè)骨壁，暴露下牙槽神經(jīng)。用頭寬2 mm 的無齒顯微血管鉗分別鉗夾神經(jīng)遠(yuǎn)近端，鉗夾強(qiáng)度為神經(jīng)呈扁平狀并保持連續(xù)性，持續(xù)5 s，然后把血管鉗旋轉(zhuǎn)180°，間隔1 mm 處再次鉗夾5 s，確保對(duì)所有大鼠壓榨的力量及時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)均保持一致(對(duì)照側(cè)只暴露神經(jīng)行假手術(shù))，關(guān)閉切口，復(fù)蘇后回籠常規(guī)飼養(yǎng)?？瞻讓?duì)照組不接受任何處置。

1.3 電鏡標(biāo)本制備

選取代表性時(shí)間點(diǎn)即損傷后24 h 和損傷后1周，在乙醚全身麻醉下，應(yīng)用含1%戊二醛和1%多聚甲醛的磷酸緩沖液經(jīng)左心室灌流固定動(dòng)物。剖取TG 及其神經(jīng)，經(jīng)1%鋨酸固定，梯度酒精脫水，行環(huán)氧樹脂包埋，制備70 nm 厚電鏡切片。Philp EM410(80 kV)透射電鏡下觀察TG 神經(jīng)元細(xì)胞體及其軸突中線粒體的超微結(jié)構(gòu)。

2 結(jié) 果

透射電鏡下觀察可見，空白對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組對(duì)照側(cè)TG 神經(jīng)元細(xì)胞體及其軸突中富含正常線粒體，線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)清楚，嵴致密、排列整齊，罕見線粒體的腫脹或空泡樣變性，神經(jīng)元細(xì)胞完整，胞質(zhì)內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和核糖體等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完好，見圖1。實(shí)驗(yàn)組大鼠下牙槽神經(jīng)壓榨損傷24 h后，神經(jīng)損傷側(cè)TG 神經(jīng)元細(xì)胞體中線粒體發(fā)生明顯腫脹，嵴變形扭曲、斷裂消失等結(jié)構(gòu)異常性變性，部分線粒體空泡樣變性，見圖2。1 周時(shí)，損傷側(cè)TG神經(jīng)元、無髓鞘的C 型及有髓鞘的A 型軸突中均出現(xiàn)大量空泡樣變性線粒體，見圖3、4;鏡下可見線粒體嵴溶解呈絮狀物沉積，或牽拉內(nèi)膜至一側(cè)，使線粒體呈單層膜空泡樣，部分空泡樣變性線粒體外膜斷裂，呈局部破損樣。神經(jīng)節(jié)內(nèi)C 型及A 型軸突結(jié)構(gòu)均正常，可不伴有神經(jīng)纖維的脫髓鞘退行性變性。

圖1 空白對(duì)照組TG 神經(jīng)元的正常線粒體超微結(jié)構(gòu)(A:×24400，B:×44000)Fig 1 Ultrastructure of mitochondria in naive and control TG neurons(A:×24400，B:×44000)

圖2 神經(jīng)壓榨損傷24 h 后實(shí)驗(yàn)側(cè)TG 神經(jīng)元的異常線粒體(×75300)Fig 2 Abnormal mitochondria in TG neurons at 24 h post nerve crush (×75300)

圖3 神經(jīng)壓榨損傷1 周后實(shí)驗(yàn)側(cè)C 神經(jīng)纖維內(nèi)的腫脹或空泡樣變性線粒體Fig 3 Swollen and vacuolated mitochondria in C -fibers at 1 w post nerve crush (Scale:500 nm)

圖4 神經(jīng)壓榨損傷1 周后實(shí)驗(yàn)側(cè)A 神經(jīng)纖維內(nèi)的空泡樣變性線粒體Fig 4 Vacuolated mitochondria in A - fibers at 1 w post nerve crush (Scale:500 nm)

3 討 論

目前神經(jīng)損傷的動(dòng)物模型制備包括神經(jīng)完全截?cái)鄵p傷、疏松結(jié)扎、壓榨損傷等諸多方法。下牙槽神經(jīng)支配下頜牙齒及牙周組織，走行于牙槽骨內(nèi)及狹窄的組織間隙，口頜面外傷及手術(shù)操作等極易導(dǎo)致下牙槽神經(jīng)的壓迫性損傷，因此本實(shí)驗(yàn)采用下牙槽神經(jīng)壓榨損傷動(dòng)物模型，可有效的模擬臨床常見的下牙槽神經(jīng)損傷及其痛敏過程。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示，下牙槽神經(jīng)缺失，可加重牙周炎癥引起的組織破壞，延遲下頜骨的骨折愈合等［7-8］。同時(shí)，分子水平的研究證明，下牙槽神經(jīng)損傷可導(dǎo)致TG 神經(jīng)元細(xì)胞及其軸突內(nèi)眾多信號(hào)分子及離子通道的可塑性改變［9］。

神經(jīng)系統(tǒng)可塑性是其修復(fù)自身功能的特性，是痛覺過敏產(chǎn)生的基礎(chǔ)。研究提示，初級(jí)神經(jīng)元細(xì)胞的損失是神經(jīng)損傷后神經(jīng)功能障礙的最根本的原因，并且神經(jīng)元細(xì)胞的存活是神經(jīng)損傷后再生修復(fù)的先決條件［10］。線粒體功能正常與否，是決定細(xì)胞生存或死亡的關(guān)鍵因素。線粒體的四個(gè)空間都存在與線粒體功能相關(guān)的生物大分子，一般認(rèn)為，分子結(jié)構(gòu)改變?cè)谙龋δ芨淖冊(cè)诤?，線粒體結(jié)構(gòu)的改變必然影響線粒體在細(xì)胞內(nèi)所發(fā)揮的功能的改變。

正常的線粒體在電鏡下是由兩層單位膜套疊而成的封閉囊狀結(jié)構(gòu)，其內(nèi)膜向內(nèi)腔延生形成嵴膜，呈管狀或扁平的囊狀結(jié)構(gòu)，它們之間可相互連接或融合。線粒體受病理因素影響后，其超微結(jié)構(gòu)病變主要有腫脹、濃縮、溶解、結(jié)構(gòu)異常和各種包含物的沉積等變性。研究表明，線粒體的輕度腫脹尚可恢復(fù)，若發(fā)展到空泡變性則為不可逆的，空泡變性常見于各種疾病對(duì)細(xì)胞的損傷，如缺血缺氧、炎癥、腫瘤、神經(jīng)損傷等［11-12］。本研究中，實(shí)驗(yàn)組大鼠下牙槽神經(jīng)壓榨損傷24 h 后，神經(jīng)損傷側(cè)TG 神經(jīng)元細(xì)胞體及其軸突中線粒體發(fā)生腫脹、嵴溶解等結(jié)構(gòu)異常性變性。1 周后，實(shí)驗(yàn)側(cè)TG 神經(jīng)元及其軸突出現(xiàn)大量空泡樣變性線粒體。因此本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，下牙槽神經(jīng)壓榨損傷后，TG 神經(jīng)元及其軸突線粒體發(fā)生結(jié)構(gòu)異常性變性，導(dǎo)致線粒體功能障礙，進(jìn)而參與神經(jīng)損傷后的多種損傷及修復(fù)機(jī)制。

下牙槽神經(jīng)損傷是口腔臨床治療過程中的常見多發(fā)并發(fā)癥，其發(fā)生和再生治療機(jī)制復(fù)雜，已經(jīng)逐漸成為研究的熱點(diǎn)。而了解線粒體在下牙槽神經(jīng)損傷及再生修復(fù)機(jī)制中的重要角色作用，將為神經(jīng)損傷后的再生治療提供有效治療靶點(diǎn)及實(shí)驗(yàn)參考，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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