孫忠杰，劉志宇，王乃玉

(1.解放軍第404醫(yī)院泌尿外科，山東 威海 264200;2.大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院泌尿外科，遼寧 大連 116027;3.大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 病理科，遼寧大連 116027)

Shh和Stathmin在前列腺疾病中的表達及意義

孫忠杰1，劉志宇2，王乃玉3

(1.解放軍第404醫(yī)院泌尿外科，山東 威海 264200;2.大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院泌尿外科，遼寧 大連 116027;3.大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 病理科，遼寧大連 116027)

目的 探討Hedgehog(Hh)信號通路成員Sonic-hedgehog(Shh)和微管不穩(wěn)定蛋白Stathmin在前列腺增生癥和前列腺癌中的表達情況及臨床意義。方法 應用免疫組織化學方法分別檢測30例前列腺增生癥和30例前列腺癌中Shh和Stathmin蛋白的表達情況，并分析其與臨床相關參數之間的關系。結果 在前列腺癌組織與前列腺增生癥組織Shh陽性表達率分別為73.33%(22/30)與36.67%(11/30)(P＜0.01)，Stathmin陽性表達率分別為83.33%(25/30)與23.33%(7/30)，(P＜0.01)。前列腺癌中 Shh 與 Stathmin 的表達呈正相關(r=0.522，P＜0.01)。前列腺癌組織Shh和Stathmin蛋白的表達與患者PSA水平、前列腺重量間無顯著相關關系(P＞0.05)，但在腫瘤不同臨床分期(TNM)、病理分級(Gleason分級)間差異顯著(P＜0.05)。結論 Shh和Stathmin在前列腺癌的演進中起一定的重要作用。

Shh;Stathmin;前列腺癌;免疫組織化學

前列腺癌(prostatic cancer，PCA)是男性泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率有明顯的地理和種族差異，歐美地區(qū)較高，亞洲發(fā)病率較低，世界范圍內，前列腺癌的發(fā)病率在男性所有惡性腫瘤中位居第二［1］。目前，前列腺癌的治療仍以手術治療、內分泌治療和放療等為最主要的手段，對于早期前列腺癌患者治療效果尚可，但對于中晚期患者療效不甚理想。隨著分子生物學理論和技術的發(fā)展，靶向診斷治療越來越引起人們的關注。多種與前列腺疾病發(fā)生進展相關的靶向分子和蛋白被相繼發(fā)現(xiàn)，如Sonic-hedgehog(Shh)和Stathmin，這可能為前列腺癌的診斷治療提供新的靶點、新的手段。本文旨在探討Shh和Stathmin在前列腺疾病中的表達情況及臨床意義。

1 材料和方法

1.1 標本來源及臨床資料

前列腺癌標本來自大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院2008—2011年住院手術患者，共30例，年齡58～90歲，平均83.2歲，經腹或直腸B超測算前列腺重量20.18 ～102.79 g，平均 52.40 g?；颊呷朐翰?PSA水平 2.61 ～100 ng/mL，平均55.41 ng/mL。臨床分期按TNM進行分期:T1期10例，T2期9例，T3期4例，T4期7例。病理分級(Gleason分級)為:高分化4例，中分化9例，低分化17例。前列腺增生癥標本來自大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院2010—2011年前列腺增生癥住院手術患者，共30例。所有標本均經10%福爾馬林溶液固定常規(guī)石蠟包埋保存，所有病例術前均未經放化療，均經手術及病理確診且有完整臨床資料。

1.2 試 劑

所用I抗均為即用型工作液，分別為:兔抗人Shh抗體(美國chemicon公司)、兔抗人Stathmin抗體(購自武漢三鷹生物技術有限公司)。濃縮型DAB試劑盒、SP免疫組化染色試劑盒、DAB底物顯色劑均購自北京中杉金橋生物有限公司。

1.3 方 法

采用免疫組織化學法對30例前列腺增生癥和30例前列腺癌組織標本分別進行Shh和Stathmin檢測。免疫組化步驟按照試劑盒要求進行。

1.4 結果判定

Shh和Stathmin以胞漿中或胞膜上出現(xiàn)棕黃色顆粒判斷為陽性細胞，以染色強度結合陽性細胞數百分比綜合計分作定性分析。選取染色密集區(qū)，隨機地觀察5個中倍視野(×200)，算出各個視野中陽性細胞數的平均百分比數作為該切片的陽性細胞百分比進行計分:＜25%弱陽性計為1分，26% ～50%中等陽性計為2分，＞51%計為3分。染色強度則以陽性細胞呈現(xiàn)的染色特征為標準進行計分:細胞無染色計為0分，染色呈淡黃色計為1分，棕黃色計為2分，棕褐色計為3分，然后根據兩者相加所得的總分進行結果判定。0～3分為陰性(-)，4～5分為弱陽性(+)，6～7分為中度陽性(++)，8～9分為強陽性(+++)。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件包進行統(tǒng)計學分析，分類變量以百分數或直接計數表示，采用χ2檢驗或Fisher精確概率法進行統(tǒng)計分析，兩變量間的關聯(lián)分析采用Spearman秩相關或偏相關分析。P＜0.05表示差異具有顯著性意義，P＜0.01表示差異具有非常顯著性意義。

2 結 果

2.1 Shh和Stathmin在前列腺增生癥與前列腺癌組織中表達情況

Shh在前列腺癌與前列腺增生癥組織中的陽性表達率分別為 73.33%(22/30)與 36.67%(11/30)，Stathmin在前列腺癌與前列腺增生癥組織中的陽性表達率分別為83.33%(25/30)與23.33%(7/30)，其棕黃色顆粒主要表達于胞漿中或胞膜。見圖1、2。前列腺癌組織的Shh和Stathmin的陽性表達率均明顯高于前列腺增生癥組織，差異具有非常顯著性意義(P ＜0.01)。

圖1 前列腺癌中Shh蛋白陽性表達(SP×200)Fig 1 The positive expression of Shh protein in prostatic carcinoma tissues(SP×200)

圖2 前列腺癌中Stathmin的陽性表達(SP×200)Fig 2 The positive expression of Stathmin protein in prostatic carcinoma tissues(SP×200)

2.2 Shh和Stathmin蛋白的表達結果與前列腺癌患者臨床相關參數的關系

前列腺癌組織中Shh和Stathmin蛋白的表達在患者不同PSA、術前B超前列腺重量間比較差異無顯著性意義(P＞0.05)，但在不同臨床分期、病理分級間比較差異卻有顯著性意義(P＜0.05)。見表1。

表1 Shh和Stathmin蛋白的表達與前列腺癌患者臨床相關參數的關系Tab 1 The relationship between the expression and related clinic and pathological features (n)

2.3 前列腺癌中Shh蛋白和Stathmin蛋白免疫組化結果相關性分析

前列腺癌中Shh蛋白和Stathmin蛋白的表達呈正相關(r=0.522，P=0.005 ＜0.01)，見表2。

表2 Shh和Stathmin之間的相關性Tab 2 The relationship between Shh and Stathmin (n)

3 討 論

Hedgehog信號通路是一個近來研究十分熱門的通路，其成員Shh與其他信號通路(如Stathmin、Notch、EGF等)相互作用、相互影響，共同參與促進前列腺胚胎發(fā)育、前列腺癌的疾病進展。Stathmin蛋白在腫瘤發(fā)生發(fā)展中也起十分重要的作用，但對于其在前列腺癌疾病進展中的研究尚少。

3.1 Shh與前列腺癌

Hedgehog信號通路由 Hedgehog(Hh)配體(Shh、Ihh、Dhh)、2 個跨膜受體復合物:Patched(Ptc)和Smoothened(Smo)、下游轉錄因子Gli家族(Gli1、Gli2、Gli3)等組成。Shh對哺乳動物的毛發(fā)、前列腺、乳腺、肺和神經系統(tǒng)等多器官的發(fā)育起重要作用［2］。Shh的表達為前列腺發(fā)育的起始所必需，采用抗RT-PCR的方法檢測Dhh和Ihh在前列腺發(fā)育過程中表達，沒有發(fā)現(xiàn)Dhh的表達，而Ihh的表達量極低［3］。采用抗Shh抗體或者Hh通路阻斷劑作用于小鼠泌尿生殖竇，可導致前列腺的導管形成障礙［4］。Fan 等［5］報道 Shh 表達在前列腺上皮，Gli1則表達在前列腺基質，并認為Shh過度表達將增加基質上的Gli1表達，從而刺激癌細胞的生長。

Karhadkar等［6］研究發(fā)現(xiàn)癌旁正常組織、局限性前列腺癌、轉移性前列腺癌均表達Shh和Ihh，但正常前列腺組織不表達 Ptch和 Gli。Sanchez等［7］對前列腺癌和良性前列腺增生癥進行檢測，與＜1%的正常組織Shh表達相比，其中33%的腫瘤標本Shh高度表達(P＜0.05)，同時其用 RT-PCR對前列腺癌細胞系檢測，發(fā)現(xiàn)其Shh、Ptch1、Gli1、Gli2和Gli3均高度表達。本實驗中，Shh蛋白在前列腺增生癥中不表達或低表達，而在前列腺癌中有高表達，差異具有非常顯著性意義(P＜0.01)。因此，認為Shh存在于前列腺癌疾病發(fā)生、發(fā)展的過程中，并可能對前列腺癌的進展起重要作用。

本研究還分析了Shh蛋白的表達情況同前列腺癌患者的臨床參數(PSA、術前前列腺重量、臨床分期、病理分級)的關系。結果表明，前列腺癌組織中Shh蛋白的表達在患者不同PSA、術前B超前列腺重量間比較差異無顯著性意義(P＞0.05)，但在不同臨床分期、病理分級間比較差異有顯著性意義(P＜0.05)，臨床分期越晚、病理分化程度越低，則Shh表達水平就越高。但這一結果與Sanchez等［7］的研究相反，其研究發(fā)現(xiàn)Shh與Gleason評分或臨床分期之間均沒有關聯(lián)性，考慮是由于本研究方法不同及標本數量有限等原因造成的，這一結果有待進一步證實。

3.2 Stathmin與前列腺癌

Stathmin蛋白是一種微管不穩(wěn)定蛋白［8］，在大量的組織和物種中廣泛存在，表達于細胞質內。

Stathmim作為腫瘤標志物，現(xiàn)已證實在多種惡性腫瘤(如白血病、淋巴瘤、前列腺癌、肺癌、宮頸癌等)中都有高水平表達。有研究發(fā)現(xiàn)Stathmin表達最早出現(xiàn)在前列腺胚胎發(fā)育早期，隨后在前列腺增生癥、PIN、前列腺癌進展過程中Stathmin的表達量逐漸增多［9］。Mistry等［10］將腺病毒介導的抗 Stathmin核酶轉染前列腺癌細胞系，結果抑制了癌細胞系惡性表型的表達，使癌細胞分裂停止在G2/M期，大部分細胞進入程序性凋亡。Mistry等［11］又將腺病毒介導的抗Stathmin核酶注入人前列腺癌細胞的裸鼠成瘤模型中發(fā)現(xiàn)30%腫瘤生長明顯抑制，70%腫瘤生長幾乎完全停止。以上都說明Stathmin與前列腺癌密切相關。本研究發(fā)現(xiàn)Stathmin蛋白在前列腺增生癥組織中不表達或低表達，在前列腺癌中有高表達，差異具有非常顯著性意義(P＜0.01)。因此，同樣認為Stathmin存在于前列腺癌疾病發(fā)生、發(fā)展的過程，可能對前列腺癌的進展起重要作用。

Friedrich［12］研究發(fā)現(xiàn)Stathmin表達水平與前列腺癌的細胞分化程度、組織學分級有關，本實驗同樣驗證這一結論。本實驗結果表明前列腺癌組織中Stathmin的表達程度在患者不同PSA、術前B超所測前列腺重量間比較差異無顯著性意義 (P＞0.05)，但在不同臨床分期、病理分級間比較差異卻有顯著性意義(P＜0.05)，臨床分期越晚、病理分化程度越低，則Stathmin表達水平越高。

3.3 Shh和Stathmin的相關性

目前對于Shh和Stathmin二者之間的關系研究甚少，Chung MK 等［13］研究了前列腺癌細胞 AT2.1株系和DU-145株系以及8例前列腺癌患者的手術標本，發(fā)現(xiàn)Stathmin的表達可能受Hedgehog信號通路蛋白的調節(jié)。本實驗發(fā)現(xiàn)Shh和Stathmin從前列腺增生癥到前列腺癌過程中表達依次增多，統(tǒng)計分析顯示前列腺癌中Shh與Stathmin的表達呈正相關。因此，可以看出Shh蛋白和Stathmin蛋白在前列腺癌病變過程中表達模式相似，在腫瘤的侵襲轉移中可能發(fā)揮著類似的功能，推測二者之間可能存在某些聯(lián)系，其相互作用可能對前列腺癌的進展起重要作用。但由于本實驗標本較少，結論的可靠性有待進一步研究證明。

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Expressions of Shh and Stathmin in prostatic diseases and their clinical significances

SUN Zhong - jie1，LIU Zhi- yu2，WANG Nai- yu3
(1.The No.404Hospital of PLA，Weihai264200，China;2.Department of Urology;3.Department of Pathology，the Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian116027，China)

［Abstract］ObjectiveTo investigate the clinical significance of Sonic-Hedgehog(Shh)and Stathmin expressions in human benign prostatic hyperplasia and prostatic carcinoma.MethodsThe expression of Shh protein and Stathmin protein are detected in 30 cases of human benign prostatic hyperplasia tissues，and 30 cases of prostatic carcinoma tissues with immunohistochemistry method.ResultsIn human prostatic carcinoma and benign prostatic hyperplasia，the positive expression rates of Shh protein were 73.33%(22/30)and 36.67%(11/30)respectively detected，the rates of Stathmin were 83.33%(25/30)and 23.33%(7/30)respectively.There was a significant differences of both protein expressions between the two groups(P＜0.05)，the rates of Shh has a positive correlation with Stathmin(r=0.522，P＜0.01).The expression of Shh or Stathmin had no correlation with the PSA level and prostate weight(P＞0.05)，but there is a singnificant difference in patients with different clinical stage and gleason score(P＜0.05).ConclusionThe expressions Stathmin and Shh may play a important role in prostatic disease progression.

［Key words］Shh;Stathmin;prostatic carcinoma;immunohistochemical

R392-33

A

1671-7295(2013)01-0034-04

孫忠杰，劉志宇，王乃玉.Shh和Stathmin在前列腺疾病中的表達及意義［J］.大連醫(yī)科大學學報，2013，35(1):34 -37.

10.11724/jdmu.2013.01.08

孫忠杰(1984-)，男，山東乳山人，醫(yī)師。E-mail:sunzhongjie521@163.com

劉志宇，教授，博士。E-mail:letter89@163.com

2012-07-05;

2012-11-30)