許 鵬，遲 強(qiáng)，盧 山，郭春梅，徐珺洋

(1.中國人民解放軍第215 醫(yī)院，遼寧 大連116041;2. 大連醫(yī)科大學(xué) 生物技術(shù)系，遼寧 大連116044)

應(yīng)激是機(jī)體受到各種內(nèi)外環(huán)境因素及社會、心理因素刺激引起的一系列全身性非特異綜合性應(yīng)答反應(yīng)，表現(xiàn)為下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸(HPA)系統(tǒng)及交感神經(jīng)-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)的興奮，并伴有眾多組織和器官的功能變化［1］。應(yīng)激動(dòng)物模型的建立是研究應(yīng)激的基礎(chǔ)，慢性束縛應(yīng)激動(dòng)物模型已被證明是一種能引起典型非特異應(yīng)激表現(xiàn)的有效方法，其可以通過剝奪動(dòng)物活動(dòng)自由而產(chǎn)生純粹的挫折應(yīng)激，這種應(yīng)激造成模型動(dòng)物心理緊張狀態(tài)，傾向于通過非特異性的心理和生理反應(yīng)表現(xiàn)出來，應(yīng)激時(shí)眾多神經(jīng)內(nèi)分泌功能發(fā)生變化，從而造成免疫功能低下，而且束縛應(yīng)激能抑制動(dòng)物體重增加［2-3］。束縛應(yīng)激與人類心身性疾病過程相似，同時(shí)又適應(yīng)應(yīng)激領(lǐng)域由急性轉(zhuǎn)入慢性的發(fā)展趨勢，被廣泛用于抑郁癥的相關(guān)研究。

本實(shí)驗(yàn)?zāi)M慢性束縛應(yīng)激過程，觀察大鼠慢性束縛應(yīng)激不同時(shí)間體重及血清中皮質(zhì)酮(CORT)，去甲腎上腺素(NE)，熱休克蛋白70 (HSP70)、白介素2 (IL-2)和白介素4 (IL-4)的變化，探討慢性束縛應(yīng)激不同時(shí)間對動(dòng)物體重、免疫功能及神經(jīng)遞質(zhì)的影響，為心理應(yīng)激功能研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對象與試劑

雄性清潔級Wistar 大鼠30 只，6 周齡，體重(90 ±3)g 購于大連醫(yī)科大學(xué)SPF 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心［合格證編號:SYXK(遼)2008 - 0002］;CORT、NE、HSP70、IL-2 和IL -4 酶聯(lián)免疫檢測試劑盒購于Abcam 公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純;酶標(biāo)儀為Thermol 公司產(chǎn)品;固定器為北京智鼠多寶生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 動(dòng)物分組

大鼠適應(yīng)環(huán)境7 d 后隨機(jī)分為3 組:正常對照組(C)、束縛3 周組(R3)和束縛5 周組(R5)，每籠5 只，飼養(yǎng)于清潔級動(dòng)物房。室內(nèi)溫度保持為(22 ±2)℃，相對濕度保持為30% ～40%，各組大鼠常規(guī)飼料，自由進(jìn)食飲水，并每日觸摸動(dòng)物以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)人員的操作。

1.3 處理方法

除正常對照組外，每天早9:00 將大鼠置于不能自由活動(dòng)的固定器內(nèi)，連續(xù)束縛6 h，1 次/d，連續(xù)束縛3 周或5 周。束縛時(shí)3 組大鼠均禁食禁水，應(yīng)激大鼠不受擠壓無損傷，不影響呼吸和排泄，但運(yùn)動(dòng)受限。首先對R5 組大鼠進(jìn)行束縛，2 周后對R3 組大鼠進(jìn)行束縛。

1.4 體重稱量

大鼠稱重均在早上進(jìn)行，所有大鼠在束縛前1天和束縛結(jié)束后第2 天均進(jìn)行1 次體重測量。

1.5 生化指標(biāo)測定

各組大鼠在束縛應(yīng)激結(jié)束后第2 天，眼球靜脈采血2 mL，室溫靜置2 h，待血液凝固后于4℃3000 r/min 離心20 min，分離血清，并置于-80 ℃保存待測。采用ELISA 法檢測CORT、NE、HSP70、IL-2 和IL-4 的含量，測定時(shí)所有樣品用生理鹽水稀釋10倍，具體操作過程嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

SPSS11.5 統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(± s)表示，差異檢驗(yàn)用方差分析和t 檢驗(yàn)，P ＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 行為變化

隨著束縛時(shí)間的延長，大鼠發(fā)生明顯的行為變化，與C 組比較，束縛組大鼠進(jìn)食量減少、行為遲緩、長期站立不動(dòng)、尖叫、不斷的淌淚、皮毛和面部不潔、毛須豎立、目光呆滯。

2.2 體重變化

慢性束縛應(yīng)激顯著抑制大鼠體重增加，與C 組相比，R3 組和R5 組大鼠分別顯著降低了29.94%和33.23%(P ＜0.05)，且隨著束縛時(shí)間延長，大鼠體重抑制越明顯，R5 組大鼠比R3 組降低了14.57%(P ＜0.05)，見表1。

表1 慢性束縛應(yīng)激對大鼠體重的影響Tab 1 The effect of chronic restraint stress on body weight

2.3 生化指標(biāo)變化

慢性束縛應(yīng)激可使大鼠血清CORT 含量升高，與C 組相比，R3 組和R5 組分別升高了11.25%和46.65%(P ＜0.05)，且具有時(shí)間依賴性，隨著束縛時(shí)間延長，含量升高越明顯，R5 組含量比R3 組升高了31.82%(P ＜0.05)。

慢性束縛應(yīng)激后，R3 組和R5 組NE 含量比C組分別顯著升高了25.16% 和39.09%(P ＜0.05)，且具有時(shí)間依賴性，隨著束縛時(shí)間延長，升高越明顯，R5 組比R3 組升高了11.13%(P ＜0.05)。

R3 組和R5 組與C 組相比HSP70 含量分別升高了5.15%(P ＞0.05)和13.49%(P ＜0.05)，R5組含量比R3 組升高了7.93%(P ＜0.05)。

與C 組相比，慢性束縛應(yīng)激后 R3 組和R5 組IL-2含量分別降低了15.43%和16.01(P ＜0.05)，但不具有時(shí)間依賴性，隨著束縛時(shí)間延長，其含量并沒有明顯降低。

慢性束縛應(yīng)激后大鼠血清中IL -4 含量升高，R3 組和R5 組分別升高了9.86%和18.69%(P ＜0.05)，且具有時(shí)間依賴性，R5 組比R3 組升高了8.04%(P ＜0.05)。見表2。

表2 慢性束縛應(yīng)激對大鼠CORT、NE、HSP70、IL-2 和IL-4 含量的影響Tab 2 The effect of chronic restraint stress on the content of CORT，NE，HSP70，IL-2 and IL-4

3 討 論

應(yīng)激抑制大鼠體重增長的原因可能歸結(jié)于皮質(zhì)酮(COPT)升高，皮質(zhì)酮可以增加機(jī)體對胰島素的敏感性、減少食物的攝入量而導(dǎo)致體重減輕，而且皮質(zhì)酮還可促進(jìn)蛋白質(zhì)分解，抑制其合成，同時(shí)也影響糖類和脂類的代謝，這些最終導(dǎo)致體重增長緩慢［4］。本研究在束縛過程中發(fā)現(xiàn)束縛組大鼠進(jìn)食量減少，根據(jù)行為變化和體重變化初步確定造模成功。

本研究中，束縛應(yīng)激導(dǎo)致了大鼠血清CORT 升高，且束縛時(shí)間越長，對大鼠損害越明顯。因?yàn)閼?yīng)激主要激活HPA 軸，老鼠受到束縛后，由于激怒，使得交感神經(jīng)興奮，下丘腦分泌的促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(CRH)經(jīng)垂體門脈系統(tǒng)進(jìn)入垂體前葉，促使促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)產(chǎn)生，此激素作用于腎上腺皮質(zhì)，使之分泌大量的糖皮質(zhì)激素(GC，皮質(zhì)醇和皮質(zhì)酮)，最終發(fā)揮生物學(xué)作用，而GC 的分泌反過來又抑制ACTH 和CRH 的釋放，形成負(fù)反饋機(jī)制，而且GC 水平升高，導(dǎo)致海馬神經(jīng)元內(nèi)糖皮質(zhì)激素受體(GR)受損，密度下降，進(jìn)而HPA 軸脫抑制［5-8］。

NE 是由腎上腺髓質(zhì)分泌的一種兒茶酚胺激素，屬于一種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)。單胺類神經(jīng)遞質(zhì)是一類調(diào)節(jié)機(jī)體生理活動(dòng)的重要物質(zhì)，許多實(shí)驗(yàn)證明，單胺類神經(jīng)遞質(zhì)在應(yīng)激狀態(tài)下有所改變，還有研究表明大鼠抑郁樣行為可能與NE 含量升高對色氨酸代謝影響有關(guān)［9］。CORT 和NE 是研究的比較多的指標(biāo)，本研究結(jié)果與前期報(bào)道一致。

目前普遍認(rèn)為外周血清HSP70 能體現(xiàn)機(jī)體的應(yīng)激程度，慢性束縛引起大鼠血清HSP70 濃度顯著升高，提示慢性束縛對機(jī)體是損傷性因素［10］。熱休克蛋白HSP70 是一種進(jìn)化上高度保守的應(yīng)激蛋白，細(xì)胞內(nèi)HSP70 主要參與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的折疊、裝配、降解和修復(fù)過程，調(diào)節(jié)蛋白活性，介導(dǎo)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)和維護(hù)蛋白的自穩(wěn)系統(tǒng)等。正常情況下大多數(shù)組織細(xì)胞內(nèi)其含量很低，當(dāng)機(jī)體遭受各種生理、病理或心理應(yīng)激時(shí)表達(dá)會明顯增加［11］。運(yùn)動(dòng)應(yīng)激能夠誘導(dǎo)機(jī)體HSP70 生成，HSP70 的適度增加可增強(qiáng)機(jī)體的適應(yīng)能力，從而成為一種保護(hù)機(jī)制，HSP70 具有抗氧化的生物活性，對應(yīng)激有較強(qiáng)的抵抗作用［12-13］。本研究中，小鼠束縛5 周后，HSP70 明顯升高。

IL-2 主要由活化的T 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，能維持T淋巴細(xì)胞在體外的生長，并激活多種免疫細(xì)胞，還可以活化NK 細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞，分泌抗體，是調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能最主要的細(xì)胞因子之一，其水平反映了T 細(xì)胞的功能狀態(tài)［14-15］。本研究中，慢性束縛降低了大鼠血清IL-2 含量，說明束縛應(yīng)激使大鼠的免疫功能受到抑制，與前期報(bào)道一致［14-16］。

IL-4 具有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、急性期反應(yīng)、并參與機(jī)體炎癥反應(yīng)的抗感染防御作用，同時(shí)具有激活HPA 軸的作用，而且許多研究報(bào)道，束縛應(yīng)激能使HPA 軸功能亢進(jìn)［17］。但關(guān)于束縛應(yīng)激與IL-4關(guān)系的研究鮮有報(bào)道。本研究中，慢性束縛后，大鼠血清IL-4 含量升高。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:慢性束縛應(yīng)激可抑制大鼠體重增長，改變血清中CORT、NE、HSP70、IL -2 和IL-4的含量，可成為重要的分子靶標(biāo)，為各種相關(guān)心身性疾病的防御和治療提供分子生物學(xué)基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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