陳禹含，張 莉，趙永利，白雪梅，王朝暉，劉正娟

(1.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 兒科，遼寧 大連116027;2.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 實(shí)驗(yàn)中心，遼寧 大連116027)

近年來(lái)，肥胖的發(fā)病率越來(lái)越高，已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)的公共衛(wèi)生問題，肥胖及由它引起的各種代謝性疾病已經(jīng)成為威脅人類健康的重要原因之一［1］，肥胖及其相關(guān)的代謝綜合征已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，高脂飲食作為一個(gè)重要的環(huán)境因素在肥胖發(fā)生中的作用是不容忽視的。目前認(rèn)為肥胖癥伴隨著一種慢性低度炎癥反應(yīng)，稱之為“代謝性炎癥反應(yīng)”［2］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這種代謝性炎癥反應(yīng)可以通過Toll 樣受體途徑引發(fā)。Toll 樣受體(Toll like receptor，TLRs)是天然免疫系統(tǒng)識(shí)別病原微生物的主要受體，在天然免疫反應(yīng)中具有重要的作用，該受體具有介導(dǎo)炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能，在肥胖相關(guān)性的炎癥中發(fā)揮著重要的作用。目前研究發(fā)現(xiàn)TLRs 家族有多個(gè)成員，其中Toll 樣受體4(Toll -like receptor 4，TLR4)被認(rèn)為是引起肥胖相關(guān)性炎癥反應(yīng)最主要的TLRs。本實(shí)驗(yàn)主要研究Toll 樣受體4 在肥胖大鼠下丘腦及肝臟中的表達(dá)，以期進(jìn)一步探討飲食誘導(dǎo)肥胖發(fā)生的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼料配制

(1)選用4 周齡的健康，雄性Sprague -Dawley(SD)大鼠，體重(80.31 ±1.36)g，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。(2)基礎(chǔ)飼料:碳水化合物65%，脂肪15%，蛋白質(zhì)20%，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;高脂飼料:碳水化合物20%，脂肪60%，蛋白質(zhì)20%，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司。

1.2 主要試劑

TLR4 抗體購(gòu)自香港Abcam Ltd. 公司，水合氯醛購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司，SP 試劑盒和DAB 試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，TRIzol 試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司，Real Time PCR 試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，PCR 引物由大連寶生物工程有限公司合成。

1.3 動(dòng)物模型的制備

4 周的健康雄性SD 大鼠30 只，隨機(jī)分為兩組，對(duì)照組(CON 組)10 只，實(shí)驗(yàn)組(DIO 組)20 只。對(duì)照組給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組給予高脂飼料喂養(yǎng)，2 只一籠飼養(yǎng)，自由攝食和飲水，每周稱量體重1次。8 周后，以超出對(duì)照組平均體重20%的大鼠作為肥胖標(biāo)準(zhǔn)［3］，肥胖復(fù)制成功的為肥胖組。

所有大鼠術(shù)前隔夜空腹，經(jīng)10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉，分別從肥胖組和對(duì)照組隨機(jī)選取大鼠，大鼠麻醉成功后開胸以4%甲醛溶液心臟內(nèi)灌注，迅速斷頭取全腦組織，取視交叉及其后4 mm 腦組織。剪開上腹部，取出部分肝臟塊。將下丘腦及肝臟浸泡于4%甲醛溶液中固定，備做免疫組化的測(cè)定。其余部分大鼠斷頭取全腦組織，在4℃冰面上，按Paxinos 和Watson 的大鼠腦立體定位圖譜分別于視交叉前和乳頭體后用刀片垂直切割，剝離大腦及周圍組織，取出下丘腦塊。剪開上腹部，取出部分肝臟塊。將下丘腦和肝臟塊迅速置于凍存管，-80℃保存，Real Time PCR 測(cè)定TLR4 mRNA的含量。

1.4 免疫組織化學(xué)方法

將甲醛固定后的下丘腦與肝臟組織常規(guī)石蠟包埋，冠狀切片。下丘腦組織按照SD 大鼠腦立體定位圖譜，從視交叉開始冠狀切片，至弓狀核處。采用免疫組織化學(xué)SP 法，按試劑盒的操作步驟，石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟，乙醇水化，梯度酒精浸泡，沖洗，甩干;3%過氧化氫室溫孵育20 min，PBS 洗滌3 次;枸櫞酸鹽緩沖液浸泡，放入微波爐加熱至沸騰，室溫冷卻，PBS 洗滌3 次;加1∶100 的TLR4 一抗4℃冰箱過夜;室溫復(fù)溫，PBS 沖洗3 次;加生物素化二抗工作液(山羊抗小鼠)，37℃下孵育30 min，PBS 沖洗3次;加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃下孵育30 min，PBS 沖洗3 次;二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色;蘇木精復(fù)染;脫水及封片。用PBS 代替一抗作為陰性對(duì)照，陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.5 Real Time PCR 方法測(cè)定下丘腦及肝臟中TLR4 mRNA 的表達(dá)量

下丘腦及肝臟中總RNA 的提取用Trizol RNA 提取液抽提，并對(duì)其進(jìn)行Dnase 處理，采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR 方法檢測(cè)TLR4 mRNA 表達(dá)水平。TLR4 上游引物:5’- CCGCTCTGGCATCATCTTCA-3’，下游引物:5’- CCCACTCGAGGTAGGTGTTTCTG - 3’;由Light Cycler Real Time pcr 分析儀完成，總反應(yīng)體積為20 μL。反應(yīng)條件:95℃30 s，95℃5 s，60℃30 s，40個(gè)循環(huán)。以ACTB(上游引物:5’-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3’，下游:5’-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3’)作為內(nèi)參照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS13.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所得數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，各計(jì)量資料的比較采用t 檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P ＜0.01 為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠生長(zhǎng)狀況

實(shí)驗(yàn)前，兩組SD 大鼠體重分別為(80. 69 ±9.91)g，(80.40 ±11.61)g，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P ＞0.05。喂養(yǎng)8 周后，給予高脂飲食的SD 大鼠體重增加較普通喂養(yǎng)的對(duì)照組明顯，肥胖復(fù)制成功的13只(13/20)為肥胖組，肥胖組平均體重為(456.38 ±19.20)g，對(duì)照組平均體重(372.10 ±22.47)g，兩組間差異有顯著性意義(P ＜0.01);肥胖組飲食量為(1229.23 ±57. 29)g，對(duì)照組飲食量為(905. 50 ±52.17)g，兩組大鼠飲食量之間差異也有顯著性意義(P ＜0.01)，見表1。

表1 肥胖組大鼠與對(duì)照組大鼠的體重與飲食量Tab 1 The weight and food intake comparison of rat between obese and control group

2.2 TLR4 蛋白在下丘腦弓狀核及肝臟組織中的表達(dá)

免疫組化染色結(jié)果顯示，肥胖組下丘腦弓狀核區(qū)TLR4 的表達(dá)呈棕黃色染色，為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(圖1A)，對(duì)照組下丘腦弓狀核區(qū)TLR4 的表達(dá)呈弱表達(dá)(圖1B);肥胖組肝臟TLR4 的表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性(圖2A)，對(duì)照組弱表達(dá)(圖2B)。

2.3 下丘腦組織中TLR4 mRNA 表達(dá)水平

兩組大鼠下丘腦及肝臟組織中TLR4 mRNA 均有表達(dá)。肥胖組大鼠下丘腦TLR4 mRNA 水平為(0.56 ± 0. 16)，高 于 對(duì) 照 組TLR4 mRNA 水 平(0.39 ±0. 10)，P ＜0. 05;肥胖組大鼠肝臟TLR4 mRNA 水平為(0.87 ±0.24)，高于對(duì)照組TLR4 mRNA 水平(0.54 ±0.16);兩組間差異有顯著性意義(P ＜0.01)，見表2。

圖1 TLR4 蛋白在大鼠下丘腦弓狀核中的表達(dá)(免疫組化染色 ×200)Fig 1 Expression of TLR4 in hypothalamic arcuate nucleus of rats(Immunohistochemical staining ×200)

圖2 TLR4 蛋白在大鼠肝臟組織中的表達(dá)(免疫組化染色 ×400)Fig 2 Expression of TLR4 in liver of rats (Immunohistochemical staining ×400)

表2 兩組大鼠下丘腦及肝臟中TLR4 mRNA 的含量Tab 2 The TLR4 mRNA express in hypothalamus and liver in two groups

3 討 論

目前肥胖作為影響人類生命健康的十大威脅之一己經(jīng)受到了廣泛的重視。但人們對(duì)肥胖認(rèn)知還很有限，不能對(duì)肥胖進(jìn)行清楚的指導(dǎo)和有效的防治。大量研究發(fā)現(xiàn)肥胖個(gè)體通常伴隨著炎性因子分泌增加，為了區(qū)別于傳統(tǒng)炎癥，人們把肥胖伴隨的炎癥稱為“代謝性炎癥反應(yīng)”。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)作為肥胖發(fā)生重要危險(xiǎn)因素的高脂飲食可以與免疫系統(tǒng)交互作用，導(dǎo)致肥胖及相關(guān)代謝綜合征炎性反應(yīng)的發(fā)生［4］。在免疫和代謝系統(tǒng)之間存在著一個(gè)共通的調(diào)控途徑，使其通過共同的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子和信號(hào)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)交互調(diào)控。

1997年Wang 等［5］首次發(fā)現(xiàn)與果蠅Toll 蛋白同源的人Toll 蛋白基因及其編碼的Toll 樣受體蛋白，此后研究不斷深入。Toll 樣受體4(Toll - like receptor 4，TLR4)是天然免疫系統(tǒng)中識(shí)別病原微生物的主要受體，在天然免疫反應(yīng)中具有極其重要的作用，是機(jī)體非特異性炎癥反應(yīng)鏈的啟動(dòng)蛋白。TLR4 主要在免疫細(xì)胞表面表達(dá)［6］，包括TLR4 單核/巨噬細(xì)胞，樹突細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞，廣泛參與機(jī)體對(duì)感染的適應(yīng)性免疫反應(yīng)，在炎癥性疾病和免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用［7］。最近的研究發(fā)現(xiàn)，在代謝性細(xì)胞(脂肪細(xì)胞，肌肉細(xì)胞及肝臟細(xì)胞)及神經(jīng)細(xì)胞表面也有TLR4 的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，特定情況下，TLR4 可在細(xì)胞表面過度表達(dá)和激活，造成組織器官結(jié)構(gòu)和功能損害［8］。該受體在生物界具有廣泛的同源性，目前基于科學(xué)界對(duì)TLR4的認(rèn)識(shí)，TLR4 在炎癥反應(yīng)過程中免疫系統(tǒng)對(duì)外源性、內(nèi)源性抗原的識(shí)別和信號(hào)傳導(dǎo)起到了重要作用。因此，探索TLR4 在外周及中樞組織分布表達(dá)特異性的研究中具有重要意義。

在外周組織中，TLR4 介導(dǎo)的代謝性炎癥反應(yīng)是由肥胖者血清中明顯升高的游離飽和脂肪酸所引發(fā)的［9］。飽和脂肪酸與TLR4 結(jié)合，激活TLR4，其胞內(nèi)TIR 結(jié)構(gòu)域募集相關(guān)接頭蛋白，進(jìn)一步激活下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。目前已知的TLR4 介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)包括MyD88 依賴性和非依賴性途徑。MyD88 依賴性途徑主要是介導(dǎo)NF -κB 的活化、細(xì)胞因子的產(chǎn)生，與相關(guān)因子一起，誘導(dǎo)相關(guān)促炎癥因子的表達(dá)，引發(fā)炎癥反應(yīng)［10］。而MyD88 非依賴性途徑主要是LPS 誘導(dǎo)干擾素，可誘導(dǎo)干擾素誘導(dǎo)蛋白10(IFN -inducible protein 10，IP-10)、糖皮質(zhì)激素衰減反應(yīng)基因16(glucocorticoid arrenuated response gene 16，GARG - 16)、干擾素調(diào)節(jié)基因1(IFN - regulated gene1，IRG-1)表達(dá)和樹突狀細(xì)胞的成熟，最終引起炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)研究中，利用免疫組織化學(xué)方法和Real Time PCR 方法證明TLR4 在肥胖大鼠肝臟組織中表達(dá)增多，證實(shí)TLR4 參與了肥胖相關(guān)外周組織中的炎癥反應(yīng)。

目前最新的研究認(rèn)為，肥胖相關(guān)的代謝性炎癥反應(yīng)是一種全身炎癥反應(yīng)，不僅存在于外周組織中，而且也存在于中樞下丘腦中。促炎癥因子在肥胖大鼠的下丘腦表達(dá)增加，同時(shí)伴有促炎癥信號(hào)通路的活化。本實(shí)驗(yàn)研究中，免疫組化方法結(jié)果提示，TLR4 在飲食誘導(dǎo)肥胖大鼠的下丘腦弓狀核(ARC)表達(dá)明顯增加，進(jìn)一步的Real Time PCR 檢測(cè)證實(shí)下丘腦TLR4 mRNA 表達(dá)也明顯增加，提示TLR4 參與肥胖相關(guān)性下丘腦中樞炎癥反應(yīng)。

TLR4 可以作為控制炎癥反應(yīng)及預(yù)防感染的重要切入點(diǎn)，TLR4 的信號(hào)傳導(dǎo)通路及其在疾病發(fā)生發(fā)展過程中的表達(dá)情況，值得進(jìn)一步的深入研究，可以為臨床中預(yù)防和治療疾病提供新的思路和方法。

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