吳 航，姚繼紅，田曉峰，劉 健，李衛(wèi)平，劉克辛，高東雁

(1.大連醫(yī)科大學(xué) 藥理學(xué)教研室，遼寧 大連116044;2.菏澤醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校 藥學(xué)系，山東 菏澤274000;3.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院，遼寧 大連116027)

膿毒癥(sepsis)是嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷及大手術(shù)后常見的并發(fā)癥，臨床上常常伴有多器官功能障礙(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，是ICU患者主要死亡原因之一，總體死亡率為30%～40%，老年患者或伴有基礎(chǔ)疾病患者中死亡率超過70%［1-2］。國內(nèi)一項多中心流行病學(xué)調(diào)查顯示，嚴(yán)重膿毒癥在ICU 的發(fā)病率為8.68%，死亡率最高達(dá)44.7%，人均消耗醫(yī)療費(fèi)用超過1 萬美元［3］。膿毒癥發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，臨床救治十分困難，涉及感染、炎癥、免疫、凝血及組織損害等一系列基本問題，并與機(jī)體多系統(tǒng)、多器官病理生理改變密切相關(guān)［4］。

促肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth promoting factor，HGF)是一種促進(jìn)人類及動物細(xì)胞再生的生物活性小分子物質(zhì)，具有刺激肝細(xì)胞DNA 合成、促進(jìn)肝細(xì)胞再生、增強(qiáng)腫瘤壞死因子活性、穩(wěn)定細(xì)胞膜和增強(qiáng)枯否氏細(xì)胞功能作用，從而提高機(jī)體免疫力，使肝損傷得到有效康復(fù)，在肝病治療藥物中占有重要的地位。中國HGF 生產(chǎn)廠家眾多，主要集中在肝源性HGF，臨床上用于各種急慢性肝病的治療［5］。HGF 對膿毒血癥多器官損傷是否具有保護(hù)作用鮮有研究。因此，本研究探討國產(chǎn)HGF 對膿毒血癥引起多器官損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制，為擴(kuò)展HGF 新適應(yīng)證，促進(jìn)HGF 臨床應(yīng)用，降低醫(yī)療成本提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與試劑

SD 雄性大鼠60 只，SPF 級，體重180 ～220 g，大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供(許可證號SCXK(遼)2008 -0002)。促肝細(xì)胞生長因子(HGF)由威海賽洛金藥業(yè)有限公司贈送(2 mL:30 μg，批號:1005013)。SOD 試劑盒購自南京建成生物工程研究所。大鼠IL-1β ELISA 試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。白紅蛋白加氧酶-1(HO -1)抑制劑——鋅原卟啉(Znpp)購自Sigma 公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗分組及方法

將雄性SD 大鼠60 只隨機(jī)分為7 組，分別為正常對照組(n =5)、假手術(shù)組(n =5)、模型組(n =10)、HGF 高(n=10)、低(n=10)劑量治療組、HO-1 抑制劑處理組(n=10)和HGF 高劑量治療+HO-1抑制劑干擾組(n=10)。假手術(shù)組只打開腹腔，暴露盲腸，不進(jìn)行結(jié)扎。模型組及給藥組進(jìn)行盲腸結(jié)扎穿孔法(CLP)手術(shù)。術(shù)前12 h 及術(shù)后每12 h 給藥1 次，正常對照組、假手術(shù)組、模型組和HO-1 抑制劑處理組動物尾靜脈注射生理鹽水10 mL/kg·d;HGF 高、低劑量治療組和HGF 高劑量治療+HO-1 抑制劑干擾組動物分別尾靜脈注射HGF 150 μg/kg·d、75 μg /kg·d 和150 μg /kg·d;HO -1 抑制劑處理組和HGF 高劑量治療+HO-1 抑制劑干擾組給藥2 h 后靜脈注射HO-1 抑制劑——Znpp。

CLP 制備膿毒血癥大鼠模型，即:大鼠吸入適量乙醚麻醉后，仰位固定，沿腹正中線打開腹腔，暴露盲腸，盲腸中部1/2 處結(jié)扎，結(jié)扎處遠(yuǎn)端的盲腸用16#針頭穿孔2 個，并且在盲腸腔內(nèi)注射生理鹽水1 mL。將盲腸送回腹腔，關(guān)腹。動物皮下注射生理鹽水1 mL。術(shù)后，將動物放回籠中等待其蘇醒。

觀察并記錄術(shù)后72 h 內(nèi)動物存活率及一般狀態(tài)。術(shù)后72 h 存活的大鼠處死，立即分離腹主動脈取血，靜置后離心(3000 r/min，20 min)取血清，-40℃凍存。選取肺、腎和腸組織固定于4%多聚甲醛溶液中，用于HE 染色觀察病理學(xué)改變。其余組織用冰生理鹽水10%勻漿，采用南京建成試劑盒測定SOD 活性。

1.3 血清IL-1β 含量的測定

取出血清標(biāo)本按照ELISA 試劑盒說明書測定各組大鼠血清中IL-1β 含量。當(dāng)天全部測定結(jié)束。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 HGF 對膿毒血癥大鼠動物活動情況及死亡率的影響

正常組和假手術(shù)組動物蘇醒后，活動基本如常。而模型組術(shù)后2 h 開始活動明顯減少，并逐漸出現(xiàn)嗜睡、少動、厭食、豎毛、呼吸加快、寒戰(zhàn)、精神萎靡以及對外界刺激反應(yīng)淡漠等表現(xiàn)，24 h 內(nèi)死亡率最高。HGF 高劑量組72 h 內(nèi)未見死亡，活動基本如假手術(shù)組;低劑量組死亡率也低于模型組。術(shù)后72 h處死動物開腹，正常組和假手術(shù)組腹腔未見腹水，肝外觀無異常，無異常氣味;模型組大鼠腹腔大量黃色膿性腹水或血樣腹水，結(jié)扎盲腸變黑、遠(yuǎn)端盲腸腸腔充滿氣體，呈氣球樣，伴有惡臭味。HGF 低、高劑量治療組均能減輕腹水。HGF 可降低CLP 后大鼠死亡率，見表1。

表1 HGF 對CLP 術(shù)后72 h 內(nèi)大鼠死亡率的影響Tab 1 Effect of HGF on mortality induced by CLP within 72 h in rats

2.2 HGF 對膿毒血癥大鼠病理改變的影響

2.2.1 HGF 對膿毒血癥大鼠肺病理改變的影響

肺HE 染色(圖1)顯示，正常組和假手術(shù)組肺泡完整，可見極少量炎性細(xì)胞浸潤，可見極少數(shù)毛細(xì)血管擴(kuò)張(圖1a);而模型組肺泡結(jié)構(gòu)被破壞，肺泡腔內(nèi)充滿纖維素，可見大量中性粒細(xì)胞浸潤，部分毛細(xì)血管擴(kuò)張，少數(shù)紅細(xì)胞滲出，可見纖維素絲連接成網(wǎng)穿過肺泡間孔與相鄰肺泡內(nèi)的纖維素網(wǎng)連接(圖1b)。經(jīng)HGF 治療后，可見肺泡擴(kuò)張明顯減弱，肺泡壁增厚及肺泡腔內(nèi)纖維素沉積劑量依賴性減弱，炎性細(xì)胞浸潤和毛細(xì)血管擴(kuò)張得到緩解(圖1c和1d)。

給予HO-1 抑制劑后肺泡結(jié)構(gòu)被破壞，肺泡腔內(nèi)充滿纖維素，可見大量中性粒細(xì)胞浸潤，多數(shù)毛細(xì)血管擴(kuò)張，可見紅細(xì)胞滲出，可見纖維素絲連接成網(wǎng)穿過肺泡間孔與相鄰肺泡內(nèi)的纖維素網(wǎng)連接(圖1e)。而HGF 處理的HO -1 抑制劑組肺損傷緩解較弱(圖1f)。

圖1 HGF 對CLP 誘導(dǎo)的大鼠膿毒血癥肺損傷病理改變的作用Fig 1 Effects of HGF treatment on CLP-induced pulmonary histology changes in rats

2.2.2 HGF 對膿毒血癥大鼠腸病理改變的影響

腸HE 染色(圖2)顯示，正常組和假手術(shù)組腸壁各層結(jié)構(gòu)完整，可見極少量炎性細(xì)胞浸潤(圖2a);模型組腸壁各層可見浸潤的炎性細(xì)胞，絨毛破損，淋巴組織增生，腸黏膜下層增厚，水腫，腸腔內(nèi)可見少量壞死的組織(圖2b)。HGF 高低劑量均可以減輕小腸絨毛破損，減少各層炎性細(xì)胞浸潤，緩解腸黏膜下層增厚和水腫，抑制淋巴組織增生(圖2c 和2d)。HO - 1 抑制劑處理后，腸壁損傷增強(qiáng)(圖2e)。HO -1 抑制劑+ HGF 給藥組緩解作用較弱(圖2f)。

2.2.3 HGF 對膿毒血癥大鼠腎病理改變的影響

腎HE 染色(圖3)顯示，正常組和假手術(shù)組動物腎小球結(jié)構(gòu)正常，僅見少量腎小管細(xì)胞輕度水腫(圖3a);模型組腎小球數(shù)量減少，腎小管水腫，可見腎小管擴(kuò)張，炎性細(xì)胞浸潤(圖3b)。HGF 高低劑量組均可見腎小球結(jié)構(gòu)基本正常，腎小管細(xì)胞水腫和炎性細(xì)胞浸潤明顯劑量依賴性減輕(圖3c 和3d)。HO-1 抑制劑處理后，腎小球數(shù)量減少，腎小管水腫，腎小管擴(kuò)張，炎性細(xì)胞浸潤，甚至可見腎小管充血，纖維素滲出(圖3e)。HO-1 抑制劑+HGF給藥組緩解作用較弱(圖3f)。

2.3 HGF 對膿毒血癥大鼠血清IL -1β 含量和組織中SOD 活性的影響

與正常對照相比，假手術(shù)組血清IL-1β 含量略有升高，但是差異無顯著性意義;肺、腎和腸中SOD活性均無明顯差異(P ＞0.05)。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠的血清IL - 1β 水平顯著升高(P ＜0.05)，相當(dāng)于假手術(shù)組的2.4 倍;同時肺、腎和腸中SOD 活性均顯著降低(P ＜0.05)，分別相當(dāng)于假手術(shù)組的52%、63%和80%。與模型組相比，靜脈注射HGF 降低大鼠血清IL -1β 水平(P ＜0.05)，高低劑量組分別相當(dāng)于模型組的68%和83%;HGF顯著增強(qiáng)肺、腎和腸中SOD 活性(P ＜0.05)，分別相當(dāng)于模型組的1.6 和1.3 倍(肺)、1.2 和1.1 倍(腎)、1.4 和1.1 倍(腸)。HO -1 抑制劑鋅原卟啉升高膿毒血癥大鼠IL -1β 水平，降低了肺、腎和腸中SOD 活性(P ＜0.05)，HGF 的作用可被HO -1抑制劑Znpp 部分拮抗(表2)，與抑制劑組相比差異無顯著性意義。

圖2 HGF 對CLP 誘導(dǎo)的大鼠膿毒血癥腸損傷病理改變的作用Fig 2 Effects of HGF treatment on CLP-induced intestinal histology changes in rats

圖3 HGF 對CLP 誘導(dǎo)的大鼠膿毒血癥腎損傷病理改變的作用Fig 3 Effects of HGF treatment on CLP-induced renal histology changes in rats

表2 HGF 對CLP 術(shù)后72 h 大鼠血清IL-1β 和肺、腎、腸中SOD 活性的影響Tab 2 Effect of HGF on IL-1βin serum and SOD in tissue after CLP 72 h in rats

3 討 論

盲腸結(jié)扎穿孔法(cecal ligation puncture，CLP)模擬了臨床常見的急性腹膜炎的病理過程，能較好地模擬人類膿毒血癥時血液動力學(xué)、炎癥反應(yīng)及代謝功能的變化，此模型反映感染觸發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征，進(jìn)而發(fā)生嚴(yán)重膿毒血癥/膿毒性休克，乃至MODS［6］。因此，本研究采用CLP 法制備大鼠膿毒血癥動物模型，探討HGF 對多器官損傷的保護(hù)作用及可能機(jī)制。

在預(yù)實驗中，作者發(fā)現(xiàn)，盲腸穿孔的孔徑大小跟損傷程度正相關(guān)，即如果穿孔孔徑過小，則中毒癥狀較輕，感染僅局限于盲腸部位，未見明顯的多器官炎癥性損傷。如果穿孔孔徑過大，則肝、肺、腎和腸等多器官出現(xiàn)明顯的損傷，動物中毒癥狀較重，死亡率非常高。因此，本研究選擇了16#針穿孔，直徑適宜，控制模型組死亡率＜50%，且出現(xiàn)肝、肺、腎、腸等多器官炎癥反應(yīng)，成功復(fù)制了膿毒血癥大鼠模型。

多器官損傷可發(fā)展為多器官功能衰竭綜合征(MODS)［7］，在膿毒血癥發(fā)生24 h 后，同時或序貫出現(xiàn)，隨著時間延伸而加重。隨各器官衰竭，死亡率大大增加。因此，逆轉(zhuǎn)多器官損傷是降低死亡率的重要措施。本實驗結(jié)果顯示，大鼠CLP 后，大多數(shù)動物在6 ～10 h 死亡，除肝臟損傷外，還伴有肺、腎和腸的損傷。靜脈注射HGF(150 μg /kg·d 和75 μg /kg·d)可以降低膿毒血癥所造成的多器官損傷，提高大鼠生存率。本研究發(fā)現(xiàn)，CLP 法可造成大鼠肺、腸和腎炎癥性損傷，靜脈注射HGF 可減輕損傷。而給予HO -1 抑制劑可減弱HGF 的保護(hù)作用。IL-1 稱為淋巴細(xì)胞活化因子，分為IL -1α 和IL-1β 兩種。IL-1β 主要存在于血液循環(huán)中，是具有多向性生物功能的炎癥介質(zhì)，能誘發(fā)機(jī)體代謝和血流動力學(xué)明顯變化，促進(jìn)炎癥介質(zhì)生成，導(dǎo)致炎性因子“瀑布效應(yīng)”，同時還可激活凝血及補(bǔ)體系統(tǒng)，促進(jìn)黏附分子、前列腺素E2、血小板刺激因子(PAF)、糖皮質(zhì)激素等的釋放和表達(dá)，從而引起發(fā)熱、乳酸酸中毒、低血壓和不可逆性休克。并且能與TNF-α 產(chǎn)生相互協(xié)同作用引起血管擴(kuò)張和白細(xì)胞介導(dǎo)的組織壞死，從而導(dǎo)致器官衰竭［8］。本實驗數(shù)據(jù)顯示在大鼠膿毒血癥模型中，大鼠血清IL-1β 的水平明顯升高，而經(jīng)過HGF 的治療之后其水平有明顯下降，提示了HGF 可以對抗膿毒血癥引起的全身炎癥反應(yīng)從而對大鼠起到保護(hù)作用。

SOD 是體內(nèi)重要的酶類自由基清除劑之一，CLP 刺激同時使組織中抗氧化能力降低，肺、腎和腸組織內(nèi)的SOD 活性下降，本研究發(fā)現(xiàn)外源性的HGF 補(bǔ)給，有助于恢復(fù)肺、腎和腸組織的抗氧化能力，減輕氧自由基的損傷。

血紅素氧合酶1(HO-1)是體內(nèi)的一種誘導(dǎo)型二相代謝酶，能被多種因素激活，進(jìn)而發(fā)揮抗炎、抗氧化、抗凋亡和抗增殖等作用，目前已成為研究的焦點［9］。HO-1 廣泛分布在心、肺、肝、腎、腸、骨髓和內(nèi)皮細(xì)胞中，重金屬、血紅素、氧化劑、細(xì)胞因子或內(nèi)毒素等均可誘導(dǎo)HO-1 的適應(yīng)性表達(dá)，而這些刺激的共同點是造成氧化應(yīng)激，故誘導(dǎo)HO-1 高表達(dá)是氧化應(yīng)激的一種普遍標(biāo)志，也是一種保護(hù)性機(jī)制。在大鼠膿毒血癥的模型中，HO -1 抑制劑組死亡率升高，組織中SOD 活性降低。HO-1 抑制劑能顯著減弱HGF 的保護(hù)作用。因此，HGF 對CLP 誘導(dǎo)大鼠多器官損傷模型的作用與減輕全身炎癥反應(yīng)和誘導(dǎo)二相酶HO-1 的表達(dá)密切相關(guān)。

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