熊陽瓊，楊雨文，黃丁能

(豐城市中醫(yī)院，江西豐城331100)

ELISA一步法和二步法檢測HBsAg結(jié)果的對比分析

熊陽瓊，楊雨文，黃丁能

(豐城市中醫(yī)院，江西豐城331100)

乙型肝炎；ELISA；HBsAg；一步法；二步法

乙型肝炎病毒(HBV)傳播途徑廣，傳染性強(qiáng)，發(fā)病率高，我國在世界上屬于乙型肝炎病毒感染的高度流行區(qū)。HBV表面抗原(HBsAg)在HBV感染檢測中一直為最重要的標(biāo)志物，是乙肝的早期診斷指標(biāo)之一。因此，準(zhǔn)確地檢測HBsAg對于HBV感染的臨床診斷和治療有著重要的意義。為驗(yàn)證ELISA法檢測試劑盒的質(zhì)量與性能，筆者通過對2154例江西省豐城市中醫(yī)院體檢者血清及質(zhì)控血清同時(shí)用兩種方法進(jìn)行HBsAg檢測并對結(jié)果進(jìn)行對比分析，現(xiàn)分析報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源2154例健康體檢者血液樣本選自2012年3月至2012年10月江西省豐城市中醫(yī)院體檢科健康體檢者，其中男1071例，女1083例，年齡20～35歲，平均年齡25歲。

1.2 儀器德國MAGLUMI-2000全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀;雷勃MULTISKAN-MK3自動(dòng)酶標(biāo)儀；北京普朗DNX-9620A自動(dòng)洗板機(jī)。

1.3 試劑與方法ELISA一步法檢測HBsAg試劑采用北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司；二步法HBsAg試劑采用北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司。血清樣本均采用一步法和二步法平行檢測HBsAg，其操作嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行。檢測陽性樣本均用上述二種方法復(fù)檢，其結(jié)果不一致樣本再用MAGLUMI-2000全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行HBsAg的定量檢測。質(zhì)控血清購自北京康徹思坦生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的HBsAg(1.0IU/ml)質(zhì)控血清，并配制成0.5IU/ml、0.25IU/ml、0.125IU/ml待用。

1.4 結(jié)果判斷ELISA一步法和二步法結(jié)果判斷均為P/N值≥2.1(S/CO≥1)為陽性[1]。MAGLUMI-2000全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀檢測結(jié)果大于0.1IU/ml判為陽性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)處理均采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。臨床計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)分析，計(jì)量資料用t檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法同時(shí)檢測HBsAg結(jié)果2154例HB-sAg樣本檢測結(jié)果顯示ELISA一步法檢測HBsAg陰性1978例，陽性176例，陽性率為8.17%；二步法檢測HBsAg陰性1953例，陽性201例，陽性率為9.33%。ELISA一步法檢測的1978例HBsAg陰性樣本中，有25例二步法檢測為陽性，并在化學(xué)發(fā)光儀上進(jìn)行HBsAg定量檢測，23例檢測結(jié)果為(0.13～0.84)IU/ml、2例大于250IU/ml，均判定為陽性結(jié)果。一步法檢出率僅為二步法的87.56%(176/ 201)，而漏檢率為1.16%(25/2154)。二者檢出率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，結(jié)果見表1。

表1 ELISA一步法及二步法HBsAg檢測結(jié)果比較

2.2 二種方法對HBsAg質(zhì)控血清1.0IU/ml、0.5IU/ ml、0.25IU/mLml和0.125IU/ml不同濃度進(jìn)行檢測，一步法S/CO均值分別為1.46、0.85、0.52和0.24；二步法為3.68、2.25、1.77和1.10。一步法最低檢測濃度為1IU/ml，二步法為0.1～0.2IU/ml，二者靈敏度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見表2。

表2 不同濃度質(zhì)控血清檢測結(jié)果比較

3 討論

乙型肝炎病毒存在于乙型病毒性肝炎患者的血液、汁液、唾液、經(jīng)血、淚液及乳汁等分泌物中。HBV是一種嚴(yán)重危害人類健康的世界性傳染病[1]，我國更是乙肝高發(fā)區(qū)。而我國人群HBsAg攜帶率高達(dá)10%～15%[2,3]，HBsAg攜帶者總?cè)藬?shù)達(dá)1.2億左右，慢性乙肝患者多達(dá)1000萬人，造成嚴(yán)重的社會(huì)問題，其防治任務(wù)相當(dāng)艱巨。

ELISA一步法檢測HBsAg雖然簡化了操作步驟,縮短了反應(yīng)時(shí)間,已被各實(shí)驗(yàn)室廣泛使用,其應(yīng)用高親和力的單克隆HBsAb抗體,其敏感性和特異性也顯著提高。ELISA一步法[4]是將樣本和酶標(biāo)記抗體同時(shí)加入反應(yīng)孔中,因此反應(yīng)孔對血清中乙肝病毒的非特異性吸附是最常見的干擾因素[5,6]。因此實(shí)際工作中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)因樣本中HBsAg濃度過低或過高致假陰性結(jié)果。ELISA二步法[7]是將樣本加入37℃反應(yīng)孔中60 min,洗滌后再加入酶標(biāo)抗體,乙肝表面抗原雖然被吸附到反應(yīng)孔,通過洗滌可以清除掉。本次對樣本2154例檢測HBsAg結(jié)果其中一步法檢出率為8.17%，二步法為9.33%。一步法1978例陰性樣本中二步法檢出陽性25例，漏檢率為1.16%。其23例經(jīng)化學(xué)發(fā)光定量檢測為(0.13～0.84)IU/ml，提示樣本中HBsAg濃度極低，2例超過250IU/ml，顯示其樣本中HBsAg濃度過高，導(dǎo)致一步法因靈敏度較低和鉤狀效應(yīng)的發(fā)生[8]而呈假陰性結(jié)果。分析其檢測原因[9]，一步法由于血清和酶標(biāo)抗體同時(shí)加入，若HBsAg濃度過高，分別與酶標(biāo)抗體和固相抗體形成免疫復(fù)合物，不形成夾心復(fù)合物，因而產(chǎn)生鉤狀效應(yīng)而呈假陰性。二步法為向反應(yīng)微孔先加血清，經(jīng)長時(shí)間溫育，高濃度HBsAg與包被在固相乙肝表面抗體呈“飽和”性結(jié)合，洗滌后再與酶標(biāo)抗體結(jié)合形成夾心復(fù)合物而呈陽性，同時(shí)，不同濃度質(zhì)控血清檢測結(jié)果顯示一步法最低檢測濃度為1IU/ml，而二步法為0.125IU/ml，其靈敏度顯著提升，從而有效提高HBsAg檢出率，與文獻(xiàn)[6,9-11]報(bào)道基本一致。

實(shí)踐證明ELISA一步法檢測HBsAg確因濃度過高或過低有“帶現(xiàn)象”，從而出現(xiàn)假陽性和假陰性而誤檢。因此，ELISA一步法檢測HBsAg時(shí)，臨床醫(yī)生與病人反映結(jié)果有誤時(shí)；通常解決方法是采用樣品稀釋后重新檢測；如果結(jié)果仍有懷疑，筆者一般采用另一種不同試劑進(jìn)行檢測，采用ELISA二步法檢測試劑為首選。由此筆者認(rèn)為解決抗原抗體過高引起“帶現(xiàn)象”而出現(xiàn)誤檢最簡便實(shí)用方法是用ELISA二步法復(fù)查。以盡量減少誤診提高檢測的陽性率，有利于臨床診斷和治療。

綜上所述，ELISA一步法雖有許多優(yōu)點(diǎn)，但存在靈敏度相對較低及鉤狀效應(yīng)，造成檢驗(yàn)結(jié)果一定程度的不可靠，建議使用ELISA二步法，雖二步法操作時(shí)間長，但可以明顯提高檢出率，減少漏檢率，為臨床提供更加客觀準(zhǔn)確的HBsAg檢測結(jié)果。

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R446.61,R512.6+2

B

1674-1129(2013)01-0096-02

10.3969/j.issn.1674-1129.2013.01.042