熊潔琦，劉絲蓀，何鳳，胡國文，修敏，胡意

(1、南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科2、南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科；3、南昌大學(xué)研究生院，江西南昌330006)

鑭化合物對腫瘤與正常組織細(xì)胞活力作用差異的體外觀察

熊潔琦1,3，劉絲蓀1，何鳳1,3，胡國文3，修敏1,3，胡意2

(1、南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科2、南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科；3、南昌大學(xué)研究生院，江西南昌330006)

目的探討氯化鑭體外對不同腫瘤及正常組織細(xì)胞活力的影響。方法采用MTT法檢測氯化鑭對腫瘤細(xì)胞系Hela、Caski的體外抑瘤效應(yīng)及對正常細(xì)胞系HUVEC、脂肪干細(xì)胞ADSCs體外毒性。結(jié)果氯化鑭濃度大于5μmol/L時對宮頸癌細(xì)胞Hela即有明顯的抑制作用(P＜0.05)；低濃度組(5μmol/L)對Caski生長略有促進(jìn)作用，其后隨著氯化鑭濃度的增高抑制作用愈見明顯，與對照組有顯著差異(P＜0.05)。而這一濃度范圍內(nèi)的氯化鑭對正常細(xì)胞系HUVEC、ADSCs無明顯毒副作用，相反可促進(jìn)細(xì)胞生長。結(jié)論一定濃度的氯化鑭對腫瘤細(xì)胞的生長增殖有明顯抑制作用，而對正常細(xì)胞的生長則有一定的促進(jìn)作用。

稀土；鑭；細(xì)胞活力；MTT

稀土元素是指元素周期表中鑭系元素及其同族的鈧和釔,共17種元素。我國稀土資源豐富，品種全，質(zhì)量好，且分布廣[1]，其特殊效應(yīng)使其廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域。就其在醫(yī)藥領(lǐng)域而言,除在消炎殺菌、免疫調(diào)節(jié)、抗凝血、鎮(zhèn)痛方面的應(yīng)用外[2-4]，近年來稀土的抑癌作用也得到廣泛的關(guān)注，多項實驗均證實稀土對腫瘤細(xì)胞有顯著的殺傷抑制作用，其中也不乏對稀土抑癌機制的探索。本實驗將對稀土氯化鑭對正常細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞體外作用的差異性進(jìn)行研究，為稀土氯化鑭作為抗癌藥物的開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株人宮頸癌細(xì)胞(Hela)、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)以及人宮頸癌細(xì)胞株(Caski)購自中科院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫。小鼠脂肪干細(xì)胞(ADSCs)由本實驗室原代分離培養(yǎng)而來。

1.2 主要試劑七水氯化鑭(SIGMA-ALDRICH，純度為99.999%);改良型RPMI1640培養(yǎng)基(Hy-Clone公司);新生牛血清(四季青公司);0.25% trypsin-EDTA(GIBCO);MTT[3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽](Solarbio);二甲基亞砜(DMSO)購于Solarbio。

1.3 檢測方法采用MTT法檢測氯化鑭對腫瘤細(xì)胞及正常細(xì)胞細(xì)胞活力的影響。將處于指數(shù)增長期細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化中和后吹打制備為單細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×105個/ml，向96孔板內(nèi)每孔加入200μl懸液，待細(xì)胞貼壁后，實驗孔給予不同濃度氯化鑭，使其終濃度范圍在200μmol/L到0μmol/L，每組濃度設(shè)置3個復(fù)孔，同

時設(shè)空白對照孔(僅加培養(yǎng)液)及調(diào)零孔。培養(yǎng)24h后棄培養(yǎng)基，每孔分別加入MTT20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h,棄MTT，每孔加入DMSO200μl，搖床震蕩10min后，在酶標(biāo)儀492nm處讀取吸光度A值，按以下公式計算細(xì)胞抑制率：細(xì)胞抑制率=(對照孔吸光值-藥物孔吸光值)/對照孔吸光值×100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件,結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。滿足方差齊性條件時,多組比較采用ANOVA法分析,多重兩兩比較采用LSD法分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度氯化鑭對腫瘤細(xì)胞活力的影響MTT結(jié)果表明，不同濃度氯化鑭對Hela細(xì)胞的抑制作用與對照孔比較均有顯著差異(P＜0.05)，且隨著氯化鑭濃度的增加，抑制率呈濃度依賴性的提高(表1)。對Caski細(xì)胞氯化鑭在低濃度組(5μmol/L)有一定的促進(jìn)生長作用，但與對照孔比較無顯著性差異；隨著氯化鑭濃度增加，對Caski細(xì)胞的抑制作用逐漸顯現(xiàn)，在50μmol/L、100μmol/L、200 μmol/L濃度組抑制作用明顯，與對照孔比較差異顯著(表1、圖1)。

表1 不同濃度氯化鑭對腫瘤細(xì)胞活力的影響

圖1 氯化鑭對不同細(xì)胞株活力的影響(*P＜0.05)

2.2 不同濃度氯化鑭對正常細(xì)胞活力的影響隨著氯化鑭濃度增高，在5μmol/L處即體現(xiàn)出對HUVEC細(xì)胞明顯的促進(jìn)生長作用，但差異無顯著性，25μmol/L處促進(jìn)生長的作用最為明顯，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，其后隨著氯化鑭濃度繼續(xù)增高促進(jìn)作用略有減弱(表2)；對ADSCs細(xì)胞低濃度組(1.56μmol/L、3.12μmol/L、6.25μmol/L、12.5μmol/L)有顯著的促進(jìn)作用(P＜0.05)，當(dāng)濃度達(dá)到25μmol/L至50μmol/L時促進(jìn)作用減弱，與對照組比較差異不顯著(表3)?？梢娐然|對臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和脂肪干細(xì)胞均未體現(xiàn)出毒性作用，相反，在一定濃度范圍內(nèi)對正常細(xì)胞株可起到促進(jìn)生長的效應(yīng)(表2、圖2)。

表2 不同濃度氯化鑭對HUVEC細(xì)胞活力的影響

表3 不同濃度氯化鑭對ADSCs細(xì)胞活力的影響

圖2 不同濃度氯化鑭對ADSCs細(xì)胞活力的影響(*P＜0.05)

3 討論

特異性高的化療藥物可以在有效抑制腫瘤細(xì)胞生長的同時，對正常細(xì)胞的生長不產(chǎn)生毒性作用，可有效地減少化療藥物的副反應(yīng)，對患者的生活質(zhì)量提高有重要影響，因而高效低毒的抗癌藥物成為新的研究熱點。稀土鑭廣泛存在于自然界，對動植物的正常生長發(fā)育有著重要作用。氯化鑭是一種非放射性的輕稀土化合物，本課題組在前期研究發(fā)現(xiàn)，氯化鑭在體內(nèi)外均表現(xiàn)出對宮頸癌明顯的抑制作用，同時從誘導(dǎo)上調(diào)抑癌相關(guān)miR-

NA方面研究了其對大腸癌HT-29細(xì)胞的生長抑制作用及機制[5]。沈立明[6]等也通過多種實驗方法證實稀土鑭可誘導(dǎo)Hela細(xì)胞發(fā)生凋亡，亦有很多文獻(xiàn)報道了稀土對其他多種不同腫瘤細(xì)胞株的抑制效應(yīng)，如王芃等[7]、王麗琴等[8]、陳惠芳等[9]、肖白等[10]分別研究發(fā)現(xiàn)氯化鑭可有效抑制前列腺癌細(xì)胞DU145、人舌癌細(xì)胞Tca8113、小鼠淋巴瘤細(xì)胞yac-1和人白血病細(xì)胞K562增殖，肖白等研究還發(fā)現(xiàn)稀土對腫瘤顯著抑制的同時，可使胃癌細(xì)胞株P(guān)AMC82惡性程度降低，分化程度升高。這都支持氯化鑭具有抗癌抑癌的效用，但對正常細(xì)胞的毒性作用研究還少有報道。本實驗著眼于在進(jìn)一步驗證氯化鑭對不同宮頸癌細(xì)胞株的抑制作用同時比較觀察其對正常細(xì)胞的毒性作用。結(jié)果證實氯化鑭在不同濃度下對宮頸癌細(xì)胞株Hela細(xì)胞和Caski細(xì)胞均體現(xiàn)出了明顯的抑制作用，與空白組比較差異顯著。且不同細(xì)胞株對氯化鑭的敏感性不同，低濃度氯化鑭(5μmol/L)即可對Hela細(xì)胞產(chǎn)生顯著的抑制作用，但對Caski細(xì)胞株尚無抑制作用的體現(xiàn)。使用pH儀檢測不同濃度氯化鑭的pH值發(fā)現(xiàn)結(jié)果均在7.4到7.5之間，可以排除氯化鑭溶液通過改變環(huán)境pH值而對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抑制作用。對于正常細(xì)胞株HUVEC及ADSCs氯化鑭無明顯毒副作用，反而可以促進(jìn)細(xì)胞生長，在低濃度范圍內(nèi)促進(jìn)作用尤為明顯。這與紀(jì)云晶等[11]報道的稀土對正常細(xì)胞株人羊膜細(xì)胞FL有促進(jìn)作用相一致，劉玉霞等[12]研究也發(fā)現(xiàn)一定濃度氯化鑭對正常細(xì)胞株神經(jīng)干細(xì)胞有促進(jìn)作用。

稀土鑭并非體內(nèi)必須元素，由于口服腸道吸收、組織積累毒性、胃腸道反應(yīng)等讓人們對其生物安全性產(chǎn)生不少質(zhì)疑[13],但稀土元素在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用價值還是逐漸得到了人們的肯定。目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為低劑量的稀土對正常組織細(xì)胞無毒性，并且在一定濃度范圍內(nèi)或可促進(jìn)細(xì)胞生長[14]。2004年10月，美國FDA批準(zhǔn)碳酸鑭(Fosrenol)針對終末期腎病患者控制高磷酸鹽血癥[15]。本實驗通過MTT法檢測比較氯化鑭對腫瘤與正常組織細(xì)胞活力也證實在一定濃度范圍內(nèi)氯化鑭抑癌的同時對正常細(xì)胞的低毒性作用，這都為稀土鑭作為臨床化療藥物的開發(fā)提供了有力的支持。

稀土化合物在醫(yī)藥領(lǐng)域的價值正日益被人們所關(guān)注，對正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞作用的差異性令其在腫瘤的治療中有著廣闊的前景。

[1]秦俊法,陳祥友,李增禧.稀土的生物學(xué)效應(yīng)[J].廣東微量元素科學(xué),2002,9(3):1-16.

[2]范瓊瑛,張雪梅,田麗瑛,等.稀土元素及其配合物生物學(xué)效應(yīng)研究進(jìn)展[J].生命科學(xué)儀器,2008,6(8):3-8.

[3]Guo F,Guo X,Xie，A et al.The Suppressive Effects of Lanthanum on the Production of Inflammatory Mediators in Mice Challenged by LPS[J].Biol Trace Elem Res,2011,142(3):693-703.

[4]Guo F,Lou Y,Feng N et al.Exposure to lanthanum compound diminishes LPS-induced inflammation-associated gene expression: involvements of PKC and NF-κB signaling pathways[J].Bio Metals,2010,23(4):669-680.

[5]余娜莎,林紅,甘自立,等.氯化鑭對人大腸癌HT_29細(xì)胞增殖及腫瘤相關(guān)microRNA變化的影響[J].實驗與檢驗醫(yī)學(xué),2011,29(2): 105-108.

[6]沈立明,蘭子堯,劉瓊,等.檸檬酸鑭誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的研究[J].中國稀土學(xué)報,2009,27(3):441-446.

[7]王芃,黃健,張?zhí)焖{(lán),等.氯化鑭抑制前列腺癌細(xì)胞DU145的生長和遷移[J].科學(xué)通報,2010,55(23):2289-2295.

[8]王麗琴,胡穎,王小平,等.稀土離子鑭與鐠對人舌癌細(xì)胞的抑制作用[J].口腔頜面外科雜志,2005,15(3):227-230.

[9]陳惠芳,齊雪松,涂序岷,等.稀土化合物對腫瘤細(xì)胞抑制作用實驗研究[J].中國稀土學(xué)報,2005,23(Suppl.):125-127.

[10]肖白,紀(jì)云晶,崔明珍,等.鑭鈰對癌細(xì)胞惡性增殖及其相關(guān)基因表達(dá)的影響[J].中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,1997,31(4):228-230.

[11]紀(jì)云晶,栗建林,王宗惠,等.輕稀土化合物抑癌作用及機制的研究[J].職業(yè)與健康,2004,20(5):1-7.

[12]劉玉霞，鄧志鋒，汪泱，等.稀土化合物氯化鑭影響神經(jīng)干細(xì)胞增殖的探討[J].實驗與檢驗醫(yī)學(xué),2008,26(5):465-467.

[13]Drüeke TB.Phosphorus metabolism and management in chronic kidney disease:Lanthanum Carbonate as a First-Line Phosphate Binder:The“Cons”[J].Seminars in Dialysis,2007,20(4):329-332.

[14]王宗惠,蘇英,龐新民,等.混合硝酸稀土對人正常細(xì)胞及癌細(xì)胞生長作用的體外觀察[J].衛(wèi)生毒理學(xué)雜志,1994,8(3):197-199.

[15]Fouad Albaaj AH.Lanthanum carbonate for the treatment of hyperphosphataemia in renal failure and dialysis patients[J].Pharmacother.2005,6(2):319－328.

The different effects of lanthanum compound on the cell activity of tumor and normal tissue in vitro

XIONG Jieqi,LIU Sisun,HE Feng,et al.Department of Gyneocology and Obstetrics,the First Affiliated Hospital of Nanchang University,Nanchang 330006,China

ObjectiveTo investigate the effects of lanthanum chloride(LaCl3)on tumor cell lines and normal cell lines in vitro. Methods MTT was employed to detect the cell viability of Hela,Caski,HUVEC,as well as the ADSCs cells in vitro,these cells are all treated with LaCl3.Results The growth and proliferation of Hela cells were inhibited significantly by LaCl3at the concentrations above 5μmol/L compared with the control group(P＜0.05);as for Caski cells,5μmol/L of LaCl3improved its growth slightly, but the growth and proliferation were suppressed gradually when the dosages of LaCl3increased from 25μmol/L(P＜0.05).LaCl3did not show any cell toxicity to the HUVEC and ADSCs cells but promoted the proliferation of them in the certain concentration range.Conclusion A certain concentration of LaCl3can inhibit the growth and proliferation of tumor cell lines,but it has the property of promoting the growth of normal cells meanwhile.

Rare earth;Lanthanum chloride;Cell viability;MTT

R73.35+1

A

1674-1129(2013)01-0007-3

10.3969/j.issn.1674-1129.2013.01.003

國家自然科學(xué)基金(81260381,81160193)；江西省科技支撐計劃(20123BBG70244)

熊潔琦，女，1989年生，南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院婦產(chǎn)科碩士研究生，主要從事婦科腫瘤的臨床和基礎(chǔ)研究工作。

胡意,男,1972年生，免疫學(xué)專業(yè)，副主任技師，研究方向為稀土生物學(xué)效應(yīng)。Email:344648162@qq.com