林 蕾， 袁海霞， 田 敬， 郭 婧， 劉曉寧， 孫紅霞， 余旭平

(1.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫病病原學(xué)與免疫控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州310058;2.湖北工業(yè)大學(xué)輕工學(xué)部，湖北 武漢430068;3.浙江省象山縣畜牧獸醫(yī)總站，浙江 寧波315700)

鵝圓環(huán)病毒(GoCV)是近年來發(fā)現(xiàn)的圓環(huán)病毒科(Circoviridae)圓環(huán)病毒屬(Circovirus)的一個(gè)新成員。與其他圓環(huán)病毒相似，鵝圓環(huán)病毒常潛伏感染，往往侵染淋巴細(xì)胞等增殖速度快的細(xì)胞，引起免疫力下降，導(dǎo)致動(dòng)物繼發(fā)感染其他病原，從而給養(yǎng)鵝業(yè)帶來重大經(jīng)濟(jì)損失［1］。鵝圓環(huán)病毒首次于1999 年由德國學(xué)者Soike 等［2］從患病鵝病理組織中發(fā)現(xiàn)，隨后中國臺(tái)灣(2003 年)、匈牙利(2004 年)等地［3-5］相繼有報(bào)道。2005 年余旭平等在中國內(nèi)地首次從浙江永康禽流感病死鵝樣品中采用PCR 方法檢測(cè)到GoCV［6］，并檢測(cè)了浙江省不同地區(qū)9 個(gè)鵝場(chǎng)的GoCV 感染情況，克隆測(cè)定了10 株GoCV 全基因組序列，初步分析了GoCV 的分子流行病情況［7］。

迄今為止，GoCV 尚不能進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)，難以獲得單一病毒株，這給GoCV 的檢測(cè)和防治帶來了難度。英國學(xué)者Scott 等嘗試建立了間接免疫熒光方法［8］，本實(shí)驗(yàn)室也進(jìn)行了GoCV 外殼蛋白的表達(dá)［9］，并應(yīng)用表達(dá)抗原建立了ELISA 方法［10］。但目前，GoCV 的檢測(cè)主要采用PCR 方法，然而常規(guī)PCR不能對(duì)組織病料中的病毒進(jìn)行定量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 將PCR 與熒光檢測(cè)相結(jié)合，可以對(duì)待檢樣品中的病毒進(jìn)行準(zhǔn)確的定性和定量。本實(shí)驗(yàn)室田敬等于2010 年建立了檢測(cè)GoCV 的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)方法［11］，但需要專門的檢測(cè)設(shè)備、相應(yīng)檢測(cè)試劑價(jià)格昂貴等，一定程度上限制了其應(yīng)用的廣泛性，特別是基層。而競(jìng)爭PCR 方法［12］是通過構(gòu)建含有目的基因的目標(biāo)模板和缺失部分序列的競(jìng)爭模板，采用同一對(duì)引物擴(kuò)增兩種大小有一定差異的DNA 片段，通過二者擴(kuò)增拷貝數(shù)比值與初始時(shí)加入相應(yīng)目的模板的分子數(shù)間的相關(guān)，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)競(jìng)爭曲線，獲得直線回歸方程，進(jìn)而推算出目的基因在樣品模板中的含量。與實(shí)時(shí)熒光定量PCR 相比，競(jìng)爭PCR 方法經(jīng)濟(jì)、方便且不需要高端設(shè)備，凡是能進(jìn)行常規(guī)PCR 的實(shí)驗(yàn)室基本上都能夠?qū)Π谢蚱芜M(jìn)行定量。本試驗(yàn)擬構(gòu)建用于競(jìng)爭PCR 的兩種模板，建立鵝圓環(huán)病毒DNA 快速定量的競(jìng)爭PCR檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

含有菌株GoCV-yk01 全長基因組的重組質(zhì)粒pMDT-GoCV-yk01，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存;鵝法氏囊組織采自象山某GoCV 陽性鵝場(chǎng)。

1.2 主要試劑

pGEM-T Easy Vector 克隆載體購自Promega 公司，pMD18-T Vector 克隆載體以及rTaq DNA 聚合酶、dNTP Mix 和各種限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa 公司;T4 DNA 連接酶購自New England Biolabs 公司;DNA marker (DL2000)購自東盛公司;A 型超純質(zhì)粒小量快速提取試劑盒購自博大泰克;凝膠回收試劑盒購自Axygen 公司。

1.3 目標(biāo)模板pGoCV625-T 的構(gòu)建

應(yīng)用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)1 對(duì)引物(g3-up:5'-TTCCTGAGTCTGCGAAAGAATG-3';g3-dn:5'-TACAATGCCGACACATCACACT-3')，以重組質(zhì)粒pMDT-GoCV-yk01 為模板，通過PCR 擴(kuò)增出目標(biāo)片段，純化后與pGEM-T Easy Vector 連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1 感受態(tài)細(xì)胞，篩選獲得的質(zhì)粒命名為pGoCV625-T(簡稱為625-T 質(zhì)粒)。

1.4 競(jìng)爭模板pGoCV300-T 的構(gòu)建

將方法1.3 中獲得的目標(biāo)片段用Sau3A I 酶消化，純化后自連，以自連產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，割膠回收大小約300 bp 的片段，純化后與pMD18-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1 感受態(tài)細(xì)胞，篩選獲得1 個(gè)插入片段大小為300 bp 的質(zhì)粒，并命名為pGoCV300-T(簡稱為300-T 質(zhì)粒)。

1.5 競(jìng)爭PCR 方法的建立

1.5.1 特異性鑒定 檢測(cè)PCR 產(chǎn)物與目的片段大小是否一致。

1.5.2 敏感性試驗(yàn) 核酸蛋白儀測(cè)定625-T 質(zhì)粒與300-T 質(zhì)粒濃度，稀釋至1.0 μl 分別含1.0 ×106、1.0 ×105、1.0 ×104、1.0 ×103、1.0 ×102拷貝，在反應(yīng)體系中分別加入1.0 μl 625-T 質(zhì)?；?00-T 質(zhì)粒單一模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，測(cè)定建立的PCR 方法能檢測(cè)到相應(yīng)模板的最低拷貝數(shù)。然后，以1.0 μl 含有1.0 ×108、1.0 × 107、1.0 × 106、1.0 × 105、1.0 ×104、1.0 ×103、1.0 ×102同等拷貝數(shù)的625-T 質(zhì)粒和300-T 質(zhì)粒的混合物為模板，進(jìn)行PCR 共擴(kuò)增，檢測(cè)在2 種模板同時(shí)存在下的擴(kuò)增極限和效率。

1.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 用固定體積(1.0 μl)的300-T 質(zhì)粒(1.0 μl 1.0 ×105拷貝)與系列倍比稀釋的625-T 質(zhì)粒(起始量為1.0 μl 含1.0 ×107拷貝，經(jīng)2-2至2-12倍比稀釋，反應(yīng)體系中加入1.0 μl)混合模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，電泳結(jié)果用BandScan 軟件分析，獲得競(jìng)爭模板(300-T 質(zhì)粒)與目標(biāo)模板(625-T 質(zhì)粒)PCR 產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度(IOD)。以競(jìng)爭模板與目標(biāo)模板的IOD 比值的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)(Y 值)，以目標(biāo)模板濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)(X 值)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程。

1.5.4 重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn) 對(duì)定量競(jìng)爭模板(300-T 質(zhì)粒)與系列倍比稀釋的目標(biāo)模板(625-T 質(zhì)粒)進(jìn)行競(jìng)爭PCR 擴(kuò)增，重復(fù)3 次，驗(yàn)證試驗(yàn)的可重復(fù)性和穩(wěn)定性。

1.6 競(jìng)爭PCR 方法的初步應(yīng)用

用實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)的2 對(duì)特異性檢測(cè)引物(gup:5'-CACTATTAATAACCCTACCTTTG-3'， g-dn:5'-ATAGCCRTCCCACCACTTCCC-3'，R = A/G，擴(kuò)增片段長度為552 bp;g3-up 和g3-dn 見方法1.3，擴(kuò)增片段長度為625 bp)對(duì)待檢法氏囊樣品進(jìn)行常規(guī)PCR 檢測(cè)，對(duì)結(jié)果呈陽性的樣品進(jìn)行競(jìng)爭PCR 檢測(cè)，以確定樣品中的病毒含量。

2 結(jié)果

2.1 目標(biāo)模板的鑒定

對(duì)構(gòu)建的目標(biāo)模板質(zhì)粒pGoCV625-T 同時(shí)采用PCR 和質(zhì)粒酶切鑒定，以目標(biāo)質(zhì)粒為模板可以擴(kuò)增出大小為625 bp 的片段(圖1-A);質(zhì)粒pGoCV625-T 經(jīng)EcoR I 和Hind Ⅲ酶切可以切出2 個(gè)片段，大小分別為625 bp (目標(biāo)模板)和3 000 bp(載體)(圖1-B)。

圖1 重組質(zhì)粒pGoCV625-T 的PCR(A)和酶切鑒定(B)Fig.1 Identification of pGoCV625-T recombinant plasmid by PCR(A)and restrition enzymes(B)

2.2 競(jìng)爭模板的鑒定

構(gòu)建的競(jìng)爭模板pGoCV300-T 中插入的片段較短，因此僅采用PCR 擴(kuò)增方法進(jìn)行鑒定。由圖2 可見，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的大小約為300 bp。

圖2 重組質(zhì)粒pGoCV300-T 的PCR 鑒定Fig.2 Identification of pGoCV300-T recombinant plasmid by PCR

2.3 單一模板與雙模板共擴(kuò)增檢測(cè)限量的測(cè)定

分別以625-T 質(zhì)粒和300-T 質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，檢測(cè)到單模板擴(kuò)增的最低限量均為1.0 μl 1.0×104拷貝。用625-T 質(zhì)粒與300-T 質(zhì)粒同等體積(1.0 μl)混合的雙模板進(jìn)行PCR 共擴(kuò)增，結(jié)果見圖3?？梢钥闯?，相同濃度的625-T 模板與300-T 模板能有效地共擴(kuò)增，且一組中兩種擴(kuò)增條帶亮度基本相同，說明其共擴(kuò)增效率基本相當(dāng)，競(jìng)爭模板與目標(biāo)模板共擴(kuò)增的檢測(cè)最低限量為1.0 μl 1.0×104拷貝。

圖3 共擴(kuò)增檢測(cè)極限的確定Fig.3 Detection limit of pGoCV625-T and pGoCV300-T recombinant plasmids by PCR co-amplification

2.4 競(jìng)爭PCR 檢測(cè)體系的構(gòu)建

用固定體積(1.0 μl)量的300-T 質(zhì)粒(1.0 μl含1.0 × 105拷貝)分別與625-T 質(zhì)粒(1.0 μl 含1.0 ×107拷貝)2-2至2-12倍比稀釋液混合，以此混合物為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，觀察2 種模板的競(jìng)爭關(guān)系，結(jié)果見圖4。競(jìng)爭PCR 電泳結(jié)果經(jīng)凝膠成像儀拍照并經(jīng)BandScan 軟件分析，獲得競(jìng)爭模板(300-T質(zhì)粒)與目標(biāo)模板(625-T 質(zhì)粒)PCR 產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度(IOD)。

圖4 不同比例的目標(biāo)模板和競(jìng)爭模板的競(jìng)爭PCR 結(jié)果Fig.4 The cPCR of mixed templates with different proportions of target and competitor

2.5 重復(fù)性和穩(wěn)定性

上述競(jìng)爭PCR 擴(kuò)增的3 次重復(fù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)基本一致，說明試驗(yàn)具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

競(jìng)爭PCR 電泳結(jié)果經(jīng)凝膠成像儀拍照并經(jīng)BandScan 軟件分析，獲得競(jìng)爭模板(300-T 質(zhì)粒)與目標(biāo)模板(625-T 質(zhì)粒)PCR 產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度(IOD)。以競(jìng)爭模板與目標(biāo)模板的IOD 比值的對(duì)數(shù)值作為縱坐標(biāo)(Y)，以目標(biāo)模板濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)(x)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程為Y =－0.831 2x+4.272 2(R2=0.992 8)。當(dāng)Y =0 時(shí)，表明兩擴(kuò)增產(chǎn)物相等，即625-T 質(zhì)粒與300-T 質(zhì)粒的PCR 產(chǎn)物量相等，通過計(jì)算得出當(dāng)初加入的標(biāo)準(zhǔn)模板625-T 質(zhì)粒為1.0 μl 1.4 ×105拷貝，而反應(yīng)體系中競(jìng)爭模板300-T 質(zhì)粒的加入量為1.0 μl 1.0 ×105拷貝，由此可見標(biāo)準(zhǔn)模板與競(jìng)爭模板的總體擴(kuò)增效率非常接近。

2.7 樣品定量檢測(cè)

對(duì)待測(cè)的鵝法氏囊組織，首先采用常規(guī)PCR 方法檢測(cè)GoCV，在GoCV 呈陽性的法氏囊樣品中，取5 份進(jìn)行病毒定量檢測(cè)，將每份研磨并混勻的法氏囊組織稱重，提取DNA 溶于100 μl DEPC 水中，取其中1.0 μl 進(jìn)行競(jìng)爭定量PCR 檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程計(jì)算起始模板濃度，再計(jì)算出鵝法氏囊組織中的病毒拷貝數(shù)。測(cè)定結(jié)果(表1)顯示陽性法氏囊組織中GoCV 病毒含量在105～106數(shù)量級(jí)，與作者之前采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)的結(jié)果相當(dāng)［10］。

表1 法氏囊中鵝圓環(huán)病毒的定量檢測(cè)Table 1 Quantitative detection of GoCV in bursa

3 討論

本研究建立了定量檢測(cè)鵝圓環(huán)病毒DNA 的競(jìng)爭PCR 方法。首先構(gòu)建了用于競(jìng)爭PCR 的pGoCV625-T 目標(biāo)模板和pGoCV300-T 競(jìng)爭模板，檢測(cè)了兩者共擴(kuò)增的檢測(cè)極限為1.0 ×104拷貝，繼而應(yīng)用300-T 競(jìng)爭模板(1.0 μl 含1.0 ×105拷貝)與不同稀釋度625-T 目標(biāo)模板(1.0 μl 含1.0 ×107拷貝，然后經(jīng)2－2至2－12共11 個(gè)梯度的倍比稀釋)混合進(jìn)行競(jìng)爭PCR 擴(kuò)增，以二者PCR 產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度(IOD)比值與目標(biāo)模板濃度的對(duì)數(shù)值間的關(guān)聯(lián)性建立了標(biāo)準(zhǔn)競(jìng)爭曲線及直線回歸方程。進(jìn)一步應(yīng)用此方法對(duì)部分GoCV 陽性鵝的法氏囊組織中的病毒量進(jìn)行定量檢測(cè)，結(jié)果與之前采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的結(jié)果相當(dāng)［10］。

由建立的競(jìng)爭PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程計(jì)算得出，本試驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)模板與競(jìng)爭模板的總體擴(kuò)增效率基本相當(dāng)。理論上，PCR 擴(kuò)增均呈2n指數(shù)增長，但實(shí)際上，可能由于反應(yīng)體系和反應(yīng)條件等多種因素，PCR 擴(kuò)增效率通常達(dá)不到理論值。在多模板存在的情況下，PCR 相對(duì)更容易擴(kuò)增短的模板，因此短模板的產(chǎn)物量就大，長模板的產(chǎn)物量則少，甚至沒有。同樣，在本試驗(yàn)建立的競(jìng)爭PCR 體系中，短的競(jìng)爭模板300-T 質(zhì)粒的擴(kuò)增效率略高，而標(biāo)準(zhǔn)模板625-T 質(zhì)粒的擴(kuò)增效率略低，但總體上二者相差不大，由此推測(cè)本試驗(yàn)建立的競(jìng)爭PCR 體系和條件具有更穩(wěn)定的競(jìng)爭擴(kuò)增效果。

崔尚金等［13］采用競(jìng)爭PCR 方法檢測(cè)了臨床樣品中豬圓環(huán)病毒2 型(PCV2)DNA 含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCV2 DNA 含量在肺中達(dá)到1.0 ml 1.0 ×108拷貝、血中1.0 ml 0.8 ×107拷貝、淋巴中1.0 ml 9.7 ×108拷貝以上時(shí)，豬表現(xiàn)出臨床癥狀，而從亞臨床感染或健康狀態(tài)的豬采集的樣品中PCV2 含量均低于此值。劉澤文等［14］用競(jìng)爭PCR 定量法最低能夠檢測(cè)雞傳染性貧血病毒DNA 1.0 μl 1.0 ×103.5拷貝。田敬等［11］建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法，GoCV 最低檢測(cè)限為1.0 μl 1.46 ×102拷貝。本研究建立的競(jìng)爭PCR 法檢測(cè)GoCV，最低檢測(cè)限為1.0 μl 1.0 ×104拷貝。相比而言，田敬等［11］建立的方法靈敏度更高，但本方法具有經(jīng)濟(jì)、方便、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，更適合擁有常規(guī)PCR 儀的基層單位開展GoCV 檢測(cè)和定量。

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