譚 暉， 胡 波， 陳萌萌， 范志宇， 魏后軍， 宋艷華， 王 芳

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇南京210014;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京210095)

兔病毒性出血癥(Rabbit hemorrhagic disease，RHD)是由兔出血癥病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV)引起的一種高度接觸性傳染?。?］，該病毒為嵌杯病毒科兔病毒屬(Lagovirus)成員［2］。病毒粒子的衣殼由32 個(gè)5 ～6 nm 大小的殼粒構(gòu)成，為一種分子量約6.0 ×104的主要結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)VP60 多重拷貝所組成［3-4］。研究證明，VP60衣殼蛋白質(zhì)在沒(méi)有其他任何成分存在的條件下，在體外可自然聚合成不包裹核酸的、與天然RHDV 病毒粒子在物理形態(tài)上類(lèi)似的病毒樣顆粒(VLPs)［5-6］。兔瘟病毒VLPs 具有很好的免疫原性，可以以胞吞或胞飲途徑進(jìn)入抗原遞呈細(xì)胞分別誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答［7］。卵清蛋白質(zhì)(OVA)第257 ～264 位氨基酸(SIINFEKL)為CD8 +T 細(xì)胞表位，這個(gè)位點(diǎn)受MHC-I 類(lèi)分子限制，具有較強(qiáng)的免疫原性［8］，常用來(lái)誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答。

法國(guó)學(xué)者Laurent 等［9］指出VP60 蛋白的C 末端組成了病毒的外表面(P 區(qū))，而N 末端構(gòu)成了衣殼的內(nèi)殼(S 區(qū))。江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所兔病與生物技術(shù)項(xiàng)目組(下文簡(jiǎn)稱(chēng)本實(shí)驗(yàn)室)對(duì)不同來(lái)源的RHDV 毒株進(jìn)行同源比對(duì)，發(fā)現(xiàn)RHDV 上存在一些高變區(qū)，這些高變區(qū)在不同RHDV 毒株中基因序列有所不同，我們又對(duì)這些高變區(qū)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)一些位點(diǎn)位于VP60 二級(jí)結(jié)構(gòu)的連接區(qū)，不參與二級(jí)結(jié)構(gòu)形成，為線(xiàn)性結(jié)構(gòu)，如502 ～510 位、411 ～417 位、302 ～309 位氨基酸。本研究分別將VP60 以上3 個(gè)區(qū)域替換為外源OVA T-細(xì)胞表位，并在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)，為研究嵌合VP60 蛋白的自聚能力及其免疫原性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 種毒(病毒)、質(zhì)粒、細(xì)胞和菌種

供體質(zhì)粒pFastBac1-VP60 由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存;大腸桿菌DH10 Bac 由本實(shí)驗(yàn)室保存;Sf9 昆蟲(chóng)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng);表達(dá)載體pFastBac1 購(gòu)自Invitrogen 公司;pMD19-T Vector 購(gòu)自TaKaRa 公司;大腸桿菌DH5α 感受態(tài)購(gòu)買(mǎi)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑和儀器

DNA Marker DL2000 及DL15000 、限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ、Hind Ⅲ、T4 DNA Ligase、凝膠回收純化試劑盒等購(gòu)自大連寶生物工程有限公司;PfxDNA 聚合酶、Taq 高保真酶、脂質(zhì)體LipofectamineTM2000 和Grace 不完全培養(yǎng)液購(gòu)自invitrogen 公司;胎牛血清購(gòu)自購(gòu)自GIBCO 公司;酶標(biāo)兔抗小鼠IgG (FITCIgG)購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司;柱式動(dòng)物RNAout 購(gòu)自北京天恩澤基因科技有限公司;DAB 顯色試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司;小鼠抗VP60 單抗A3C 為本實(shí)驗(yàn)室保存;人“O”型紅細(xì)胞取自南京軍區(qū)總醫(yī)院。柱式質(zhì)粒DNAout試劑盒、柱式動(dòng)物RNAout 購(gòu)自北京天恩澤基因科技有限公司。病毒顆粒的電鏡觀察在東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院大型儀器平臺(tái)的H-7650 型透射電鏡上操作完成。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)RHDV 皖阜株VP60 基因序列(FJ794180)和卵清蛋白質(zhì)(OVA)257 ～264aa的堿基序列，用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物(由Invitrogen 公司合成)。上游引物VP60-F:5'-TTTGAATTCATGGAGGGCAAAGCCCGCAC-3'(EcoR I);下游引物 VP60-R:5'-GCCAAGCTTTCAGACATAAGAAAAGCC-3'(Hind Ⅲ)。第1 組引物:引物1(VP60-502-R ):5'-GGATCCGAGTTTTTCAAAGTTGATTATGGAGGATCCGTTGAGCGAAAGTCCAATTG-3';引物2(VP60-510-F):5'-GGATCCTCCATAATCAACTTTGAAAAACTCGGATCCCAGTTCTTCGTTTG GCAGTT-3'。第2 組引物:引物3(VP60-411-R):5'-GGATCCGAGTTTTTCAAAGTTGATTATGGAGGAT CCGCCGGTTACCACGGCATAAA-3';引物4(VP60-417-F):5'-GGATCCTCCATAATCAACTTTGAAAAAC TCGGATCCCTGTTTGTGATGGCCTCGGG-3'。第3 組引物:引物5(VP60-302-R):5'-GGATCCGAGTTTTT CAAAGTTGATTATGGAGGATCCACTGCCTCTTCGAT GGTCAA-3';引物6(VP60-309-F):5'-GGATCCTCCATAATCAACTTTGAAAAACTCGGATCCACCAACG TGCTTCAGTTTTG-3'。

1.4 重疊區(qū)擴(kuò)增基因拼接法(SOE 法)構(gòu)建目的基因

以SOE 法(圖1)構(gòu)建第1 組重組基因片段為例，融合基因構(gòu)建方法如下:首先利用引物VP60-F和引物1 擴(kuò)增出片段1(片段1 為VP60 第1 ～502位氨基酸的堿基，末端引入OVA T 細(xì)胞表位堿基)。然后，利用引物2 和VP60-R 擴(kuò)增片段2(片段2 為前端引入OVA T 細(xì)胞表位的堿基，后為VP60 第510 ～579 位氨基酸的堿基)。兩次PCR 的產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，用DNA 快速回收純化試劑盒回收凝膠中的目的片段，回收產(chǎn)物10 倍稀釋后作為第3 次PCR 的模板。第3 次PCR 反應(yīng)體系(SOE反應(yīng)):10 ×高保真PCR 緩沖液5.0 μl，2.5 mmol/L的dNTP 4.0 μl，PCR 1 和2 回收產(chǎn)物10 倍稀釋后各4.0 μl，Taq 高 保 真DNA 聚 合 酶0.2 μl，50 mmol/L MgSO42.0 μl。94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性30 s，37 ℃退火2 min，68 ℃延伸1 min，15 個(gè)循環(huán);68 ℃延伸5 min，結(jié)束反應(yīng)。

圖1 重疊區(qū)擴(kuò)增基因拼接(SOE)法示意圖Fig.1 Diagram of splicing by overlap extension (SOE)method

第3 次PCR 完成后，向體系中添加上游引物VP60-F 和下游引物VP60-R，進(jìn)行第4 次PCR 反應(yīng)。PCR 條件為:94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性30 s，53℃退火30 s，68 ℃延伸2 min，25 個(gè)循環(huán);68 ℃延伸5 min，結(jié)束反應(yīng)。電泳得到第一組重組基因片段。外源OVA T 細(xì)胞表位取代VP60 蛋白上相應(yīng)位點(diǎn)(圖2)。

圖2 OVA T 細(xì)胞表位置換VP60 氨基酸區(qū)域得到的3 組重組蛋白質(zhì)示意圖Fig.2 Schematic diagram of the three recombinant proteins obtained by the OVA T cell epitopes replacing corresponding regions on VP60

PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外燈下切下含目的條帶的瓊脂糖塊，用DNA 快速回收純化試劑盒回收凝膠中的目的片段，與pMD19-T 載體4 ℃過(guò)夜連接。連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，均勻涂布于事先37 ℃預(yù)熱的氨芐LB平板(100 μg/ml)上，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑單個(gè)菌落到5 ml 氨芐LB 中搖床過(guò)夜培養(yǎng)，柱式質(zhì)粒DNAout試劑盒提取重組質(zhì)粒。得到的質(zhì)粒DNA 進(jìn)行限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ、Hind Ⅲ雙酶切鑒定。酶切過(guò)后的溶液進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下切下含有目的條帶的凝膠，回收目的片段。

1.5 重組轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建與鑒定

用T4 DNA 連接酶將含有粘性末端(位點(diǎn)為GAATTC，EcoR I 酶切位點(diǎn);AAGCTT，Hind Ⅲ酶切位點(diǎn))的pFastBac1 載體和回收的目的片段4 ℃連接12 h，轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞。37 ℃溫箱過(guò)夜培養(yǎng)，挑單菌落搖床培養(yǎng)。用試劑盒提取質(zhì)粒DNA 進(jìn)行雙酶切鑒定，得到重組轉(zhuǎn)移載體pFast-V-1、pFast-V-2、pFast-V-3。將陽(yáng)性克隆對(duì)應(yīng)的菌液送Invitrogen 公司測(cè)序。測(cè)序正確的陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)座新制備的DH10 Bac 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，獲得重組質(zhì)粒Bacmid(Bacmid-V-1、Bacmid-V-2、Bacmid-V-3)。提取大片段質(zhì)粒，以M13 上下游引物進(jìn)行PCR 鑒定。PCR 循環(huán)條件為:95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后取10 μl 產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.6 重組穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Sf9 細(xì)胞

經(jīng)PCR 鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒，以脂質(zhì)體LipofectamineTM2000 為共轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染Sf9 單層細(xì)胞。轉(zhuǎn)染在24 孔板上進(jìn)行，轉(zhuǎn)染后每12 h 觀察1次，直到細(xì)胞病變明顯時(shí)，收集細(xì)胞及上清液，得到3 種重組桿狀病毒rBac-v-1、rBac-v-2、rBac-v-3，以此作為重組桿狀病毒原液4 ℃保存。病毒原液按照1∶ 50 的比例感染Sf9 細(xì)胞，出現(xiàn)病變后，收集細(xì)胞和上清，此為第2 代病毒液。依此方法得到第7 代病毒液，此時(shí)病毒純度較高。

1.7 RT-PCR 鑒定重組病毒

收集第2 代感染重組病毒的Sf9 細(xì)胞，按照柱式動(dòng)物RNAout 試劑盒說(shuō)明書(shū)，提取桿狀病毒RNA，以目的基因上下游引物進(jìn)行RT-PCR。RT 反應(yīng)條件為:30 ℃反應(yīng)10 min，42 ℃反應(yīng)30 min，99 ℃反應(yīng)5 min，5 ℃5 min。PCR 反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性1 min，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.8 表達(dá)產(chǎn)物的鑒定

1.8.1 間接免疫熒光檢測(cè)( IFA) 于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，將重組病毒接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Sf9 細(xì)胞，培養(yǎng)至發(fā)生病變時(shí)，以本實(shí)驗(yàn)室制備的RHDV 單抗A3C 為一抗(1∶ 40)，采用間接免疫熒光法檢測(cè)嵌合蛋白質(zhì)的表達(dá)。

1.8.2 蛋白質(zhì)電泳(SDS-PAGE) 將重組桿狀病毒液以1∶ 100 的體積比感染Sf9 細(xì)胞。5 d 后輕輕吹下病變細(xì)胞，連同培養(yǎng)液一起分裝于1.5 ml 離心管中，3 000 r/min離心5 min 分離細(xì)胞和上清，棄上清。用PBS 重懸細(xì)胞，洗滌3 次，加入200 μl PBS，反復(fù)凍融3 次。加入5×上樣緩沖液，煮沸5 min，11 000 r/min離心2 min，取上清20 μl 進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳。

1.8.3 免疫印跡( Western blot) 鑒定 采用半干轉(zhuǎn)印法。同方法1.8.2將樣品電泳后，取下凝膠，將其轉(zhuǎn)印于NC 膜上，2 mA/cm2轉(zhuǎn)印70 min。以RHDV單抗A3C 為一抗(1∶ 100)，羊抗兔IgG-HRP 為二抗(1∶ 2 000)，進(jìn)行Western blot 鑒定。

1.9 電鏡觀察

取第7 代重組病毒2 ml 接入100 ml 密度為1 ml 2 ×106個(gè)的Sf9 細(xì)胞懸浮液，培養(yǎng)6 d。取30 ml 培養(yǎng)液，3 000 r/min離心5 min，棄培養(yǎng)液。沉淀用5 ml PBS 重懸，12 000 r/min離心5 min，棄上清。洗滌3 次后，用1 ml PBS 重懸沉淀。反復(fù)凍融3次，12 000 r/min離心5 min，取上清，用于電鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 重疊區(qū)擴(kuò)增基因拼接法(SOE 法)獲得目的基因及其鑒定

以本實(shí)驗(yàn)室保存的pFastBac1-VP60 為模板，利用primer5.0 設(shè)計(jì)退火溫度，用設(shè)計(jì)的各組引物，各進(jìn)行4 次PCR，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，獲得符合目標(biāo)片段大小的條帶。目的基因與T 載體連接轉(zhuǎn)化后，進(jìn)行雙酶切鑒定，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到與預(yù)期片段大小一致的特異條帶，成功構(gòu)建3 組克隆質(zhì)粒。

2.2 重組表達(dá)載體的酶切鑒定

T/A 鑒定后，目的片段與真核表達(dá)載體pFaster-Bac1 連接，轉(zhuǎn)化DH10 Bac 感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定。1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，得到與預(yù)期片段大小一致的特異條帶，同時(shí)測(cè)序結(jié)果表明成功構(gòu)建嵌合VP60 重組質(zhì)粒。

2.3 重組Bacmid 鑒定

用PCR 方法鑒定目的基因是否插入到Bacmid中。以pUC/M13 上游引物和下游引物對(duì)重組質(zhì)粒的擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為3 000 bp，而以pUC/M13 上、下游引物對(duì)未插入外源基因片段的空Bacmid 質(zhì)粒的擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為300 bp，證明轉(zhuǎn)座成功，重組桿狀病毒基因構(gòu)建完成。

2.4 表達(dá)產(chǎn)物的鑒定

2.4.1 細(xì)胞病變 在脂質(zhì)體LipofectamineTM2000介導(dǎo)下，將3 種重組質(zhì)粒Bacmid-V-1、Bacmid-V-2、Bacmid-V-3 轉(zhuǎn)染Sf9 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染5 d 后，對(duì)照細(xì)胞和轉(zhuǎn)染細(xì)胞顯示不同狀態(tài)。對(duì)照細(xì)胞生長(zhǎng)基本沒(méi)有變化，細(xì)胞輪廓清晰，大小均一，胞體明亮;轉(zhuǎn)染后細(xì)胞則呈現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變(CPE)，表現(xiàn)為:細(xì)胞直徑明顯增大，開(kāi)始變圓、脫落，部分細(xì)胞裂解和死亡，說(shuō)明轉(zhuǎn)染成功。

2.4.2 RT-PCR 鑒定重組病毒 按試劑盒說(shuō)明書(shū)提取各組感染第2 代重組病毒的Sf9 細(xì)胞總RNA，以正常Sf9 細(xì)胞為對(duì)照。以目的基因上下游引物進(jìn)行RT-PCR。目的條帶約為1 800 bp，與目的基因大小一致，而正常細(xì)胞無(wú)特異性條帶(圖3)。

2.4.3 蛋白質(zhì)電泳(SDS-PAGE)及免疫印跡( Western blot) 檢測(cè) 電泳和轉(zhuǎn)印結(jié)果顯示:3 種重組桿狀病毒在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)后均出現(xiàn)1 條分子量約為6.0 ×104的特異性條帶，與預(yù)期大小基本一致，說(shuō)明目的蛋白質(zhì)得到表達(dá)(圖4)。免疫印跡與電泳的目的條帶位置相符，說(shuō)明3 種嵌合蛋白質(zhì)均具有反應(yīng)原性(圖4)。

圖3 RT-PCR 鑒定重組病毒mRNAFig.3 RT-PCR of the recombinant virus mRNA

圖4 3 種嵌合蛋白免疫印跡和SDS-PAGE 電泳結(jié)果Fig.4 Western blot and SDS-PAGE of three chimeric proteins

2.4.4 間接免疫熒光檢測(cè) 重組病毒感染Sf9 細(xì)胞24 h 后，以1∶ 40 倍稀釋的RHDV 單抗A3C 為一抗，1∶ 100 稀釋度的FITC 標(biāo)記兔抗小鼠IgG 為二抗，進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè)。結(jié)果(圖5)表明，感染重組病毒的Sf9 細(xì)胞和感染VP60 皖阜株的細(xì)胞具有很強(qiáng)的特異性熒光，而感染Bacmid 的對(duì)照和空白對(duì)照無(wú)特異性熒光，說(shuō)明重組桿狀病毒在Sf9 細(xì)胞中表達(dá)。

2.5 嵌合蛋白病毒樣顆粒檢測(cè)結(jié)果

電鏡觀察結(jié)果(圖6)表明，VP60 蛋白不同位置被OVA 替換形成的3 組嵌合蛋白質(zhì)都能形成與VP60 皖阜株病毒顆粒大小和形態(tài)類(lèi)似的病毒樣顆粒(VLPs)。

3 討論

病毒樣顆粒(VLPs)作為新型疫苗既克服了傳統(tǒng)滅活疫苗免疫原性不高的缺點(diǎn)，也克服了活疫苗安全性的限制，同時(shí)具有不含有遺傳物質(zhì)，可以大量制備，有良好的安全性和免疫原性等優(yōu)點(diǎn)［10-13］。兔出血癥病毒VLPs 展示載體的研究尚在起步階段，目前在N 末端、C 末端、306 ～307 位插入或替換外源B 細(xì)胞表位或T 細(xì)胞表位片段的研究較多。Barcena 等［14］、Nagesha 等［15］研究認(rèn)為在C 端插入外源氨基酸不會(huì)改變VP60 形成VLPs 的能力。Crisci等［8］預(yù)測(cè)P2 亞單位突環(huán)處適合外源B 細(xì)胞表位(誘導(dǎo)特異性抗體)插入，并證明插入外源片段可形成VLPs 。P2 亞單位位于衣殼蛋白質(zhì)表面，屬于免疫優(yōu)勢(shì)區(qū)域，包含VP60 第306 ～307 位氨基酸。本研究中的OVA T-細(xì)胞表位替換VP60 302 ～309 位氨基酸形成了病毒樣顆粒，表明此位點(diǎn)適合外源T細(xì)胞表位的替換，且外源片段替換后重組VP60 可形成VLPs。

圖5 間接免疫熒光檢測(cè)重組蛋白Fig.5 Indirect immunofluorescence assay of the recombinant proteins

圖6 3 組嵌合蛋白形成的病毒樣顆粒的電鏡圖Fig.6 Electron micrograph of virus-like particles formed by three chimeric proteins

嵌合型VLPs 是將外源蛋白質(zhì)與不同來(lái)源的VLPs進(jìn)行基因融合或化學(xué)結(jié)合，生成嵌合型VLPs［16］，從而誘導(dǎo)針對(duì)外源性蛋白質(zhì)表位的免疫應(yīng)答。本研究選擇了VP60 的3 個(gè)可變區(qū):502 ～510 位、411 ～417 位、302 ～309 位。此3 個(gè)位點(diǎn)的氨基酸分別用1 個(gè)OVA T細(xì)胞表位替換，經(jīng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)得到3 個(gè)重組桿狀病毒。將病毒接種細(xì)胞培養(yǎng)一定時(shí)間，得到3組重組嵌合蛋白質(zhì)Z1、Z2 和Z3。收獲處理后進(jìn)行電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)3 組重組病毒表達(dá)的嵌合蛋白質(zhì)Z1、Z2 和Z3 均可以形成VLPs，相同放大倍數(shù)的電鏡視野中Z3形成的VLPs 最多，Z2 形成的較多，Z1 形成的最少。我們認(rèn)為此處的差異可能是由于接毒時(shí)各組毒價(jià)和/或病毒量不同造成的。重組顆粒大小約為50 nm，與VP60 皖阜株病毒顆粒的形態(tài)和大小類(lèi)似，說(shuō)明此3 個(gè)位點(diǎn)分別用1 個(gè)OVA T 細(xì)胞表位替換后，能形成嵌合型VLPs。我們同時(shí)發(fā)現(xiàn)，第3 組VLPs 密度最大，易尋找;第2 組除VLPs 外還可見(jiàn)少數(shù)比VP60 稍大、透光性比VP60 好、松散的不規(guī)則團(tuán)狀物;第1 組VLPs 不易尋找，且存在很多類(lèi)似團(tuán)狀物。由于電鏡樣品在進(jìn)行SDS-PAGE 和Western blot 時(shí)顯示的雜帶較少，由此推測(cè)不規(guī)則團(tuán)狀物為未自聚成型的重組VP60 蛋白質(zhì)，說(shuō)明VP60 不同位點(diǎn)被替換，對(duì)病毒樣顆粒的自聚和組裝能力造成了不同程度的影響。由于302 ～309 位氨基酸位于VP60 P2 亞單位突環(huán)處，可能對(duì)插入的外源片段耐受性更高，對(duì)顆粒形成幾乎無(wú)影響，而502 ～510 位和411 ～417 位氨基酸的替換對(duì)VP60 顆粒形成有一定影響，因此302 ～309 位氨基酸位點(diǎn)可作為以VP60 VLPs為載體的嵌合疫苗中外源片段插入的潛在位點(diǎn)。

本研究中，免疫印跡結(jié)果表明3 種重組蛋白質(zhì)對(duì)VP60 單抗具有反應(yīng)原性，電鏡檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明能形成嵌合型VLPs，但是，VP60 中的外源OVA T-細(xì)胞表位能否引起動(dòng)物機(jī)體的細(xì)胞免疫，以及此外源片段對(duì)VP60 引起動(dòng)物機(jī)體免疫反應(yīng)的影響等還需要進(jìn)一步研究。

［1］ 蔡寶祥.家畜傳染病學(xué)［M］. 3 版. 北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1998:299-301.

［2］ GREEN KY，CHANOCK R M，KAPIKAN A Z. Human calicivirus［M］ //Knipe D M，Howley P M. Fields virology. 4th ed.Philadelphia，Pa:Lippincott Williams ＆ Wilkins，2001:841-874.

［3］ WIRBLICH C，THIEL H J，MEYERS G. Genetic map of the calicivirus rabbit hemorrhagic disease virus as deduced from In vitro translation studies［J］. Journal of Virology，1996，70(11):7974-7983.

［4］ MARTIN-ALONSO J M，CASAIS R，BOGA J A，et al. Processing of rbabbit hemorrhagic disease virus polyprotein［J］. Journal of Virology，1996，70(2):1261-1265.

［5］ BARCENA J，MORALES M，VAZQUEZ B，et al. Horizontal transmissible protection against myxomatosis and rabbit hemorrhagic disease by using a recombinant myxoma virus ［J］. J Virol，2000，74 :1114-1123.

［6］ FARNOS O，BOUE O，PARRA F，et a1. High-level expression and immunogenic properties of the recombinant rabbit hemorrhagic disease virus VP60 capsid protein obtained in Pichia pastoris［J］.J Biotech，2005，117(3):215-224.

［7］ FARNOS O，BOUE O，PARRA F，et a1. High-level expression and immunogenic properties of the recombinant rabbit hemorrhagic disease virus VP60 capsid protein obtained in Pichia pastoris［J］.J Biotech，2005，117(3):215-224.

［8］ CRISCI E，ALMANZA H. Chimeric calicivirus-like particles elicit protective anti-viral cytotoxic responses without adjuvant［J］.Virology，2009，387 :303-312.

［9］ LAURENT S，KUT E，REMY-DELAUNAY S，et al. Folding of the rabbit hemorrhagic disease virus capsid protein and delineation of N-terminal domains dispensable for assembly［J］. Arch Virol，2002，147:1559-1571.

［10］ KEIM B. Controversy over cendcal cancer vaccine spurs safety surveil1ance［J］. Nat Med，2007，13(4):392-393.

［11］ VILLA L L，COSTA R L，PETTA C A，et a1. Prophylactic quadrivalent human papillomavirus (types 6，l1，16，and 18)L1 vireslike particle vaeeine in young women:a randomised double-blind placebo-controlled muhicentre phase II eficacy trial［J］. Lancet Oncol，2005，6(5):271-278.

［12］ 蓖 晨，孟繼鴻. 一種新型戊型肝炎病毒樣顆粒的表達(dá)、純化及其免疫原性［J］.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2006，22(3):339-342.

［13］ HAMMONDS J，CHEN X，ZHANG X，et a1. Advances in methods for the production，purification and characterization of HIV-1 gag-envpseudovirion vaccines［J］. Vaccine，2007，25(47):8036-8048.

［14］ BARCENA J，VERDAGUER N，RAMóN R，et al.The coat protein of rabbit hemorrhagic disease virus contains a molecular switch at the N-terminal region facing the inner surface of the capsid［J］.Virology ，2004，322 (1):118-134.

［15］ NAGESHA H S，WANG L F，HYATT A D.Virus-like particles of calicivirus as epitope carriers［J］. Arch Virol，1999，144 (12):2429-2439.

［16］ RAMQVIST T，ANDRESESAN A，DALIANIS T.Vaccination，imnlune and gene therapy based on rims-like particles against viral infections and cancer［J］.Expert Opin Biol Ther，2007，7(7):997-1007.